Bedankt voor uw bezoek aan nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we aan de nieuwste browserversie te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zal deze site bovendien geen stijlen en JavaScript bevatten.
Skeletspierweefsel is een heterogeen weefsel dat voornamelijk bestaat uit myofibrillen, die bij mensen doorgaans worden ingedeeld in drie typen: één "langzame" (type 1) en twee "snelle" (typen 2A en 2X). De heterogeniteit tussen en binnen de traditionele myofibriltypen is echter nog steeds slecht begrepen. We hebben transcriptomische en proteomische methoden toegepast op respectievelijk 1050 en 1038 individuele myofibrillen uit de menselijke vastus lateralis. De proteomische studie omvatte mannen en de transcriptomische studie 10 mannen en 2 vrouwen. Naast myosine-zwareketen-isoformen identificeerden we metabolische eiwitten, ribosomale eiwitten en cellulaire junctie-eiwitten als bronnen van multidimensionale intermyofibrillaire variabiliteit. Bovendien suggereren onze gegevens, ondanks de identificatie van clusters van langzame en snelle vezels, dat type 2X-vezels fenotypisch niet te onderscheiden zijn van andere snel samentrekkende vezels. Bovendien is een classificatie op basis van de myosine-zware keten onvoldoende om het spiervezelfenotype bij nemaline myopathieën te beschrijven. Over het geheel genomen suggereren onze gegevens een multidimensionale heterogeniteit van spiervezels, waarbij de bronnen van variatie verder reiken dan de myosine-zware keten-isoformen.
Cellulaire heterogeniteit is een inherent kenmerk van alle biologische systemen, waardoor cellen zich kunnen specialiseren om te voldoen aan de verschillende behoeften van weefsels en cellen.1 De traditionele opvatting over de heterogeniteit van skeletspiervezels was dat motorneuronen het vezeltype binnen een motorische eenheid bepalen, en dat het vezeltype (d.w.z. type 1, type 2A en type 2X bij mensen) wordt bepaald door de kenmerken van myosine-zwareketen (MYH)-isoformen.2 Dit was aanvankelijk gebaseerd op hun pH-ATPase-instabiliteit3,4 en later op hun moleculaire expressie van MYH.5 Met de identificatie en daaropvolgende acceptatie van "gemengde" vezels die meerdere MYH's in variërende verhoudingen co-expresseren, worden skeletspiervezels echter steeds meer beschouwd als een continuüm in plaats van als afzonderlijke vezeltypen.6 Desondanks vertrouwt het vakgebied nog steeds sterk op MYH als de primaire classificator voor de classificatie van spiervezels, een opvatting die waarschijnlijk beïnvloed is door de beperkingen en aanzienlijke vertekeningen van vroege studies bij knaagdieren, waarvan de MYH-expressieprofielen en het scala aan vezeltypen verschillen van die bij mensen.2 De situatie wordt verder gecompliceerd door het feit dat dat verschillende menselijke skeletspieren een divers scala aan vezeltypen vertonen.7 De vastus lateralis is een gemengde spier met een intermediair (en daarom representatief) MYH-expressieprofiel.7 Bovendien maakt het gemak waarmee monsters ervan kunnen worden genomen het de best bestudeerde spier bij de mens.
Een onbevooroordeeld onderzoek naar de diversiteit van skeletspiervezels met behulp van krachtige "omics"-instrumenten is daarom cruciaal, maar tegelijkertijd ook een uitdaging, mede door de meerkernige aard van skeletspiervezels. Transcriptomics8,9 en proteomics10 technologieën hebben de afgelopen jaren echter een revolutie in gevoeligheid doorgemaakt dankzij diverse technologische vooruitgang, waardoor analyse van skeletspieren op het niveau van individuele vezels mogelijk is. Hierdoor is aanzienlijke vooruitgang geboekt in het karakteriseren van de diversiteit van individuele vezels en hun reactie op atrofische stimuli en veroudering11,12,13,14,15,16,17,18. Belangrijk is dat deze technologische vooruitgang klinische toepassingen heeft, waardoor een meer gedetailleerde en precieze karakterisering van ziektegerelateerde ontregeling mogelijk is. De pathofysiologie van nemaline myopathie, een van de meest voorkomende erfelijke spierziekten (MIM 605355 en MIM 161800), is bijvoorbeeld complex en verwarrend.19,20 Daarom zou een betere karakterisering van de ontregeling van de skeletspiervezels kunnen leiden tot aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van deze ziekte.
We hebben methoden ontwikkeld voor transcriptomische en proteomische analyse van individuele skeletspiervezels die handmatig zijn geïsoleerd uit menselijke biopsiemonsters. Deze methoden hebben we toegepast op duizenden vezels, waardoor we de cellulaire heterogeniteit van menselijke skeletspiervezels konden onderzoeken. In het kader van dit onderzoek hebben we de kracht van transcriptomische en proteomische fenotypering van spiervezels aangetoond en metabolische, ribosomale en cellulaire junctie-eiwitten geïdentificeerd als belangrijke bronnen van variabiliteit tussen vezels. Bovendien hebben we met behulp van deze proteomische workflow de klinische relevantie van nematodenmyopathie in individuele skeletspiervezels gekarakteriseerd, waarbij we een gecoördineerde verschuiving naar niet-oxidatieve vezels hebben aangetoond, onafhankelijk van het vezeltype, gebaseerd op MYH.
Om de heterogeniteit van menselijke skeletspiervezels te onderzoeken, hebben we twee workflows ontwikkeld voor transcriptoom- en proteoomanalyse van individuele skeletspiervezels (Figuur 1A en Aanvullende Figuur 1A). We hebben verschillende methodologische stappen ontwikkeld en geoptimaliseerd, van monsteropslag en behoud van RNA- en eiwitintegriteit tot het optimaliseren van de doorvoer voor elke aanpak. Voor transcriptoomanalyse werd dit bereikt door monsterspecifieke moleculaire barcodes in te voegen in de eerste stap van de reverse transcriptie, waardoor 96 vezels konden worden samengevoegd voor efficiënte verdere verwerking. Diepere sequencing (±1 miljoen reads per vezel) in vergelijking met traditionele single-cell-benaderingen verrijkte de transcriptoomgegevens verder.21 Voor proteomics gebruikten we een korte chromatografische gradiënt (21 minuten) in combinatie met DIA-PASEF-data-acquisitie op een timsTOF-massaspectrometer om de proteoomdiepte te optimaliseren en tegelijkertijd een hoge doorvoer te behouden. 22,23 Om de heterogeniteit van gezonde skeletspiervezels te onderzoeken, hebben we de transcriptomen van 1050 individuele vezels van 14 gezonde volwassen donoren en de proteomen van 1038 vezels van 5 gezonde volwassen donoren gekarakteriseerd (Aanvullende tabel 1). In dit artikel worden deze datasets respectievelijk de 1000-vezeltranscriptomen en -proteomen genoemd. Onze aanpak detecteerde in totaal 27.237 transcripten en 2983 eiwitten in de transcriptomische en proteomische analyses van de 1000 vezels (Figuur 1A, Aanvullende datasets 1-2). Na het filteren van de transcriptomische en proteomische datasets op >1000 gedetecteerde genen en 50% geldige waarden per vezel, werden vervolgens bio-informatische analyses uitgevoerd voor respectievelijk 925 en 974 vezels in het transcriptoom en proteoom. Na filtering werden gemiddeld 4257 ± 1557 genen en 2015 ± 234 eiwitten (gemiddelde ± SD) per vezel gedetecteerd, met beperkte interindividuele variabiliteit (Aanvullende figuren 1B–C, Aanvullende datasets 3–4). De variabiliteit binnen proefpersonen was echter meer uitgesproken tussen deelnemers, waarschijnlijk door verschillen in RNA-/eiwitopbrengst tussen vezels van verschillende lengtes en dwarsdoorsneden. Voor de meeste eiwitten (>2000) lag de variatiecoëfficiënt onder de 20% (Aanvullende figuur 1D). Beide methoden maakten het mogelijk om een breed dynamisch bereik van transcripten en eiwitten vast te leggen met sterk tot expressie gebrachte signaturen die belangrijk zijn voor spiercontractie (bijv. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Aanvullende figuren 1E–F). De meeste geïdentificeerde kenmerken waren gemeenschappelijk voor de transcriptomische en proteomische datasets (aanvullende figuur 1G), en de gemiddelde UMI/LFQ-intensiteiten van deze kenmerken waren redelijk goed gecorreleerd (r = 0,52) (aanvullende figuur 1H).
Transcriptomics- en proteomicsworkflow (gemaakt met BioRender.com). BD Dynamische bereikcurven voor MYH7, MYH2 en MYH1, en berekende drempelwaarden voor vezeltype-toewijzing. E, F Distributie van MYH-expressie over vezels in transcriptomics- en proteomicsdatasets. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP)-plots voor transcriptomics en proteomics, gekleurd op basis van MYH-gebaseerd vezeltype. I, J Kenmerkplots die de expressie van MYH7, MYH2 en MYH1 in transcriptomics- en proteomicsdatasets weergeven.
We wilden aanvankelijk aan elke vezel een MYH-gebaseerd vezeltype toewijzen met behulp van een geoptimaliseerde aanpak die gebruikmaakt van de hoge gevoeligheid en het dynamische bereik van MYH-expressie in omics-datasets. Eerdere studies gebruikten willekeurige drempelwaarden om vezels te labelen als puur type 1, type 2A, type 2X of gemengd, gebaseerd op een vast percentage expressie van verschillende MYH's11,14,24. Wij gebruikten een andere aanpak waarbij de expressie van elke vezel werd gerangschikt op basis van de MYH's die we gebruikten om de vezels te typeren: MYH7, MYH2 en MYH1, overeenkomend met respectievelijk type 1, type 2A en type 2X vezels. Vervolgens berekenden we wiskundig het onderste buigpunt van elke resulterende curve en gebruikten dit als drempelwaarde om vezels toe te wijzen als positief (boven de drempelwaarde) of negatief (onder de drempelwaarde) voor elke MYH (Figuur 1B–D). Deze gegevens tonen aan dat MYH7 (Figuur 1B) en MYH2 (Figuur 1C) op RNA-niveau duidelijkere aan/uit-expressieprofielen hebben dan op eiwitniveau. Op eiwitniveau bleken er inderdaad maar heel weinig vezels te zijn die geen MYH7 tot expressie brachten, en geen enkele vezel had 100% MYH2-expressie. Vervolgens gebruikten we vooraf vastgestelde expressiedrempels om op MYH gebaseerde vezeltypen toe te wijzen aan alle vezels in elke dataset. Zo werden MYH7+/MYH2-/MYH1- vezels toegewezen aan type 1, terwijl MYH7-/MYH2+/MYH1+ vezels werden toegewezen aan het gemengde type 2A/2X (zie Aanvullende Tabel 2 voor een volledige beschrijving). Door alle vezels samen te voegen, observeerden we een opmerkelijk vergelijkbare verdeling van MYH-gebaseerde vezeltypen op zowel RNA- (Figuur 1E) als eiwitniveau (Figuur 1F), terwijl de relatieve samenstelling van MYH-gebaseerde vezeltypen, zoals verwacht, varieerde tussen individuen (Aanvullende figuur 2A). De meeste vezels werden geclassificeerd als ofwel puur type 1 (34-35%) of type 2A (36-38%), hoewel er ook een aanzienlijk aantal gemengde type 2A/2X-vezels werd gedetecteerd (16-19%). Een opvallend verschil is dat pure type 2X-vezels alleen op RNA-niveau konden worden gedetecteerd, maar niet op eiwitniveau, wat suggereert dat snelle MYH-expressie ten minste gedeeltelijk post-transcriptioneel wordt gereguleerd.
We hebben onze op proteomics gebaseerde MYH-vezeltyperingsmethode gevalideerd met behulp van antilichaam-gebaseerde dot blotting, en beide methoden vertoonden 100% overeenstemming bij het identificeren van zuivere type 1- en type 2A-vezels (zie Aanvullende Figuur 2B). De op proteomics gebaseerde aanpak was echter gevoeliger en efficiënter in het identificeren van gemengde vezels en het kwantificeren van het aandeel van elk MYH-gen in elke vezel. Deze gegevens tonen de effectiviteit aan van het gebruik van een objectieve, zeer gevoelige op omics gebaseerde aanpak voor het karakteriseren van skeletspiervezeltypen.
Vervolgens gebruikten we de gecombineerde informatie van transcriptomics en proteomics om spiervezels objectief te classificeren op basis van hun complete transcriptoom of proteoom. Door de Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)-methode te gebruiken om de dimensionaliteit te reduceren tot zes hoofdcomponenten (aanvullende figuren 3A-B), konden we de variabiliteit van spiervezels in het transcriptoom (figuur 1G) en proteoom (figuur 1H) visualiseren. Opvallend is dat spiervezels in zowel de transcriptomics- als de proteomicsdatasets niet gegroepeerd waren op basis van deelnemers (aanvullende figuren 3C-D) of testdagen (aanvullende figuur 3E), wat suggereert dat de variabiliteit binnen een individu in skeletspiervezels groter is dan de variabiliteit tussen individuen. In de UMAP-plot kwamen twee afzonderlijke clusters naar voren die "snelle" en "langzame" spiervezels vertegenwoordigen (figuren 1G-H). MYH7+ (langzame) spiervezels waren geclusterd aan de positieve pool van UMAP1, terwijl MYH2+ en MYH1+ (snelle) spiervezels geclusterd waren aan de negatieve pool van UMAP1 (Figuren 1I–J). Er werd echter geen onderscheid gemaakt tussen snel samentrekkende spiervezeltypen (d.w.z. type 2A, type 2X of gemengd 2A/2X) op basis van MYH-expressie, wat suggereert dat de expressie van MYH1 (Figuur 1I–J) of andere klassieke 2X-spiervezelmarkers zoals ACTN3 of MYLK2 (Aanvullende figuren 4A–B) geen onderscheid maakt tussen verschillende spiervezeltypen wanneer het gehele transcriptoom of proteoom in beschouwing wordt genomen. Bovendien waren er, vergeleken met MYH2 en MYH7, weinig transcripten of eiwitten die positief gecorreleerd waren met MYH1 (Aanvullende figuren 4C–H), wat suggereert dat de abundantie van MYH1 het transcriptoom/proteoom van de spiervezel niet volledig weerspiegelt. Vergelijkbare conclusies werden getrokken bij de beoordeling van de gemengde expressie van de drie MYH-isoformen op UMAP-niveau (aanvullende figuren 4I-J). Hoewel 2X-vezels dus op transcriptniveau kunnen worden geïdentificeerd op basis van MYH-kwantificatie alleen, zijn MYH1+-vezels niet te onderscheiden van andere snelle vezels wanneer het gehele transcriptoom of proteoom in beschouwing wordt genomen.
Als eerste verkenning van de heterogeniteit van langzame spiervezels, naast MYH, hebben we vier bekende, voor langzame spiervezels specifieke eiwitten onderzocht: TPM3, TNNT1, MYL3 en ATP2A22. De subtypes van langzame spiervezels vertoonden hoge, hoewel niet perfecte, Pearson-correlaties met MYH7 in zowel transcriptomics (Aanvullende figuur 5A) als proteomics (Aanvullende figuur 5B). Ongeveer 25% en 33% van de langzame spiervezels werden niet geclassificeerd als pure langzame spiervezels door alle gen-/eiwitsubtypen in transcriptomics (Aanvullende figuur 5C) en proteomics (Aanvullende figuur 5D), respectievelijk. Classificatie van langzame spiervezels op basis van meerdere gen-/eiwitsubtypen introduceert dus extra complexiteit, zelfs voor eiwitten waarvan bekend is dat ze vezeltypespecifiek zijn. Dit suggereert dat vezelclassificatie op basis van isovormen van een enkele gen-/eiwitfamilie mogelijk niet adequaat de werkelijke heterogeniteit van skeletspiervezels weerspiegelt.
Om de fenotypische variabiliteit van menselijke skeletspiervezels op het niveau van het gehele omics-model verder te onderzoeken, hebben we een onbevooroordeelde dimensionaliteitsreductie van de data uitgevoerd met behulp van principale componentenanalyse (PCA) (Figuur 2A). Net als bij UMAP-plots hadden noch de deelnemer noch de testdag invloed op de vezelclustering op PCA-niveau (Aanvullende figuren 6A-C). In beide datasets werd het op MYH gebaseerde vezeltype verklaard door PC2, die een cluster van langzame type 1-vezels en een tweede cluster met snelle type 2A-, type 2X- en gemengde 2A/2X-vezels liet zien (Figuur 2A). In beide datasets waren deze twee clusters verbonden door een klein aantal gemengde type 1/2A-vezels. Zoals verwacht bevestigde de overrepresentatieanalyse van de belangrijkste PC-drivers dat PC2 werd aangestuurd door contractiele en metabolische kenmerken (Figuur 2B en Aanvullende figuren 6D-E, Aanvullende datasets 5-6). Over het geheel genomen bleek het op MYH gebaseerde vezeltype voldoende te zijn om de continue variatie langs PC2 te verklaren, met uitzondering van de zogenaamde 2X-vezels die verspreid waren over het transcriptoom binnen de snelle cluster.
A. PCA-plots (Principal Component Analysis) van transcriptoom- en proteoomdatasets, gekleurd op basis van vezeltype volgens MYH. B. Verrijkingsanalyse van transcript- en eiwitdrivers in PC2 en PC1. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het clusterProfiler-pakket en Benjamini-Hochberg-gecorrigeerde p-waarden. C, D. PCA-plots, gekleurd op basis van intercellulaire adhesie-genontologie (GO)-termen in het transcriptoom en costameer-GO-termen in het proteoom. Pijlen geven transcript- en eiwitdrivers en hun richtingen weer. E, F. UMAP-plots (Uniform Manifold Approximation and Projection) van klinisch relevante kenmerken die expressiegradiënten tonen, onafhankelijk van het type langzame/snelle vezels. G, H. Correlaties tussen PC2- en PC1-drivers in transcriptomen en proteomen.
Verrassend genoeg verklaarde het op MYH gebaseerde myofibertype slechts de op één na grootste mate van variabiliteit (PC2), wat suggereert dat andere biologische factoren die niet gerelateerd zijn aan het op MYH gebaseerde myofibertype (PC1) een belangrijke rol spelen bij het reguleren van de heterogeniteit van skeletspiervezels. Oververtegenwoordigingsanalyse van de belangrijkste drijvende krachten in PC1 onthulde dat de variabiliteit in PC1 voornamelijk werd bepaald door cel-celadhesie en ribosoomgehalte in het transcriptoom, en costameren en ribosomale eiwitten in het proteoom (Figuur 2B en Aanvullende Figuren 6D-E, Aanvullende Dataset 7). In skeletspieren verbinden costameren de Z-schijf met het sarcolemma en zijn ze betrokken bij krachtoverdracht en signalering. 25 Geannoteerde PCA-plots met behulp van cel-celadhesie (transcriptoom, Figuur 2C) en costameren (proteoom, Figuur 2D) lieten een sterke verschuiving naar links zien in PC1, wat aangeeft dat deze kenmerken verrijkt zijn in bepaalde vezels.
Een meer gedetailleerd onderzoek van de clustering van spiervezels op UMAP-niveau onthulde dat de meeste kenmerken een spiervezeltype-onafhankelijke, op MYH gebaseerde expressiegradiënt vertoonden in plaats van een spiervezelsubcluster-specifieke gradiënt. Deze continuïteit werd waargenomen voor verschillende genen die geassocieerd zijn met pathologische aandoeningen (Figuur 2E), zoals CHCHD10 (neuromusculaire ziekte), SLIT3 (spieratrofie) en CTDNEP1 (spierziekte). Deze continuïteit werd ook waargenomen in het gehele proteoom, inclusief eiwitten geassocieerd met neurologische aandoeningen (UGDH), insulinesignalering (PHIP) en transcriptie (HIST1H2AB) (Figuur 2F). Gezamenlijk duiden deze gegevens op continuïteit in de vezeltype-onafhankelijke heterogeniteit van langzame/snelle spiercontracties in verschillende spiervezels.
Interessant genoeg vertoonden de drivergenen in PC2 een goede transcriptoom-proteoomcorrelatie (r = 0,663) (Figuur 2G), wat suggereert dat langzame en snelle spiervezeltypen, en met name de contractiele en metabolische eigenschappen van skeletspiervezels, transcriptioneel gereguleerd worden. De drivergenen in PC1 vertoonden echter geen transcriptoom-proteoomcorrelatie (r = -0,027) (Figuur 2H), wat suggereert dat variaties die niet gerelateerd zijn aan langzame/snelle spiervezeltypen grotendeels post-transcriptioneel gereguleerd worden. Omdat variaties in PC1 voornamelijk verklaard werden door ribosomale genontologie-termen, en gezien het feit dat ribosomen een cruciale en gespecialiseerde rol in de cel spelen door actief deel te nemen aan en invloed uit te oefenen op de eiwittranslatie,31 zijn we vervolgens op onderzoek uitgegaan naar deze onverwachte ribosomale heterogeniteit.
We hebben de plot van de proteomische principale componentenanalyse (PCA) eerst gekleurd op basis van de relatieve abundantie van eiwitten in de GOCC-term "cytoplasmatisch ribosoom" (Figuur 3A). Hoewel deze term verrijkt is aan de positieve kant van PC1, wat resulteert in een kleine gradiënt, sturen ribosomale eiwitten de verdeling in beide richtingen van PC1 (Figuur 3A). Ribosomale eiwitten die verrijkt zijn aan de negatieve kant van PC1 omvatten RPL18, RPS18 en RPS13 (Figuur 3B), terwijl RPL31, RPL35 en RPL38 (Figuur 3C) de belangrijkste drijvende krachten waren aan de positieve kant van PC1. Interessant is dat RPL38 en RPS13 sterk tot expressie kwamen in skeletspieren in vergelijking met andere weefsels (Aanvullende figuur 7A). Deze onderscheidende ribosomale signaturen in PC1 werden niet waargenomen in het transcriptoom (Aanvullende figuur 7B), wat duidt op post-transcriptionele regulatie.
A. Hoofdcomponentenanalyse (PCA) plot gekleurd op basis van cytoplasmatische ribosomale genontologie (GO) termen in het proteoom. Pijlen geven de richting aan van de door eiwitten gemedieerde variatie in de PCA plot. De lengte van de lijn komt overeen met de score van de hoofdcomponent voor een bepaald eiwit. B, C. PCA-kenmerkplots voor RPS13 en RPL38. D. Ongecontroleerde hiërarchische clusteranalyse van cytoplasmatische ribosomale eiwitten. E. Structureel model van het 80S ribosoom (PDB: 4V6X) met ribosomale eiwitten met verschillende abundanties in skeletspiervezels. F. Ribosomale eiwitten met verschillende stoichiometrie gelokaliseerd nabij het mRNA-uitgangskanaal.
De concepten van ribosomale heterogeniteit en specialisatie zijn eerder voorgesteld, waarbij de aanwezigheid van verschillende ribosoomsubpopulaties (ribosomale heterogeniteit) de eiwittranslatie in verschillende weefsels32 en cellen33 direct kan beïnvloeden door de selectieve translatie van specifieke mRNA-transcriptpools34 (ribosoomspecialisatie). Om subpopulaties van ribosomale eiwitten te identificeren die samen tot expressie komen in skeletspiervezels, hebben we een ongesuperviseerde hiërarchische clusteranalyse van ribosomale eiwitten in het proteoom uitgevoerd (Figuur 3D, Aanvullende gegevensset 8). Zoals verwacht clusterden ribosomale eiwitten niet op basis van vezeltype op basis van MYH. We identificeerden echter drie verschillende clusters van ribosomale eiwitten; het eerste cluster (ribosomal_cluster_1) wordt gecoreguleerd met RPL38 en heeft daarom een verhoogde expressie in vezels met een positief PC1-profiel. Het tweede cluster (ribosomal_cluster_2) wordt gecoreguleerd met RPS13 en is verhoogd in vezels met een negatief PC1-profiel. Het derde cluster (ribosomal_cluster_3) vertoont geen gecoördineerde differentiële expressie in skeletspiervezels en kan worden beschouwd als het "kern" ribosomaal eiwit van de skeletspieren. Zowel ribosomale clusters 1 als 2 bevatten ribosomale eiwitten waarvan eerder is aangetoond dat ze alternatieve translatie reguleren (bijv. RPL10A, RPL38, RPS19 en RPS25) en functioneel de ontwikkeling beïnvloeden (bijv. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 In overeenstemming met de PCA-resultaten vertoonde de waargenomen heterogene representatie van deze ribosomale eiwitten over de vezels ook continuïteit (Aanvullende figuur 7C).
Om de locatie van heterogene ribosomale eiwitten binnen het ribosoom te visualiseren, gebruikten we een structureel model van het humane 80S-ribosoom (Protein Data Bank: 4V6X) (Figuur 3E). Na isolatie van ribosomale eiwitten die tot verschillende ribosomale clusters behoren, bleken hun locaties niet nauw op elkaar aan te sluiten. Dit suggereert dat onze aanpak er niet in slaagde bepaalde regio's/fracties van het ribosoom te verrijken. Interessant genoeg was het aandeel van eiwitten van de grote subeenheid in cluster 2 echter lager dan in clusters 1 en 3 (Aanvullende figuur 7D). We observeerden dat eiwitten met een gewijzigde stoichiometrie in skeletspiervezels voornamelijk gelokaliseerd waren aan het ribosoomoppervlak (Figuur 3E). Dit is consistent met hun vermogen om te interageren met interne ribosoom-toegangsplaats (IRES)-elementen in verschillende mRNA-populaties, waardoor selectieve translatie wordt gecoördineerd. 40, 41 Bovendien bevonden veel eiwitten met een gewijzigde stoichiometrie in skeletspiervezels zich in de buurt van functionele gebieden zoals de mRNA-uitgangstunnel (Figuur 3F), die selectief de translatieverlenging en -stop van specifieke peptiden reguleren. 42 Samenvattend suggereren onze gegevens dat de stoichiometrie van ribosomale eiwitten in skeletspieren heterogeen is, wat resulteert in verschillen tussen skeletspiervezels.
Vervolgens wilden we de kenmerken van snel- en langzaam-samentrekkende spiervezels identificeren en de mechanismen van hun transcriptionele regulatie onderzoeken. Door de clusters van snel- en langzaam-samentrekkende spiervezels, gedefinieerd door UMAP in de twee datasets (figuren 1G-H en 4A-B), te vergelijken, identificeerden transcriptomische en proteomische analyses respectievelijk 1366 en 804 differentieel tot expressie gebrachte kenmerken (figuren 4A-B, aanvullende datasets 9-12). We observeerden de verwachte verschillen in kenmerken gerelateerd aan sarcomeren (bijv. tropomyosine en troponine), excitatie-contractiekoppeling (SERCA-isoformen) en energiemetabolisme (bijv. ALDOA en CKB). Bovendien werden transcripten en eiwitten die de ubiquitineringsgraad van eiwitten reguleren, differentieel tot expressie gebracht in snel- en langzaam-samentrekkende spiervezels (bijv. USP54, SH3RF2, USP28 en USP48) (figuren 4A-B). Bovendien was het gen voor het microbiële eiwit RP11-451G4.2 (DWORF), waarvan eerder is aangetoond dat het differentieel tot expressie komt in verschillende spiervezeltypen van lammeren43 en de SERCA-activiteit in hartspierweefsel verhoogt44, significant opgereguleerd in langzame skeletspiervezels (Figuur 4A). Op vergelijkbare wijze werden op individueel vezelniveau significante verschillen waargenomen in bekende kenmerken zoals metabolisme-gerelateerde lactaatdehydrogenase-isoformen (LDHA en LDHB, Figuur 4C en Aanvullende Figuur 8A)45,46, evenals in voorheen onbekende vezeltype-specifieke kenmerken (zoals IRX3, USP54, USP28 en DPYSL3) (Figuur 4C). Er was een significante overlap van differentieel tot expressie gebrachte kenmerken tussen de transcriptomische en proteomische datasets (Aanvullende Figuur 8B), evenals een vouwveranderingscorrelatie die voornamelijk werd gedreven door de meer uitgesproken differentiële expressie van sarcomeerkenmerken (Aanvullende Figuur 8C). Opvallend is dat sommige signaturen (bijv. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) een sterke post-transcriptionele regulatie vertoonden, uitsluitend op proteomisch niveau, en expressieprofielen hadden die specifiek waren voor het type langzame/snelle spiervezels (aanvullende figuur 8C).
A en B vulkaanplots die langzame en snelle clusters vergelijken, geïdentificeerd door de Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)-plots in Figuren 1G–H. Gekleurde stippen representeren transcripten of eiwitten die significant verschillen bij FDR < 0,05, en donkere stippen representeren transcripten of eiwitten die significant verschillen bij log change > 1. Tweeweg statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de DESeq2 Wald-test met Benjamini-Hochberg-gecorrigeerde p-waarden (transcriptomics) of de Limma lineaire modelmethode met empirische Bayesiaanse analyse gevolgd door Benjamini-Hochberg-correctie voor meervoudige vergelijkingen (proteomics). C Signature plots van geselecteerde differentieel tot expressie gebrachte genen of eiwitten tussen langzame en snelle vezels. D Verrijkingsanalyse van significant differentieel tot expressie gebrachte transcripten en eiwitten. Overlappende waarden zijn verrijkt in beide datasets, transcriptoomwaarden zijn alleen verrijkt in het transcriptoom en proteoomwaarden zijn alleen verrijkt in het proteoom. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van het clusterProfiler-pakket met Benjamini-Hochberg-gecorrigeerde p-waarden. E. Vezeltype-specifieke transcriptiefactoren geïdentificeerd door SCENIC op basis van SCENIC-afgeleide regulatorspecificiteitsscores en differentiële mRNA-expressie tussen vezeltypen. F. Profilering van geselecteerde transcriptiefactoren die differentieel tot expressie komen tussen langzame en snelle vezels.
Vervolgens voerden we een oververtegenwoordigingsanalyse uit van differentieel vertegenwoordigde genen en eiwitten (Figuur 4D, Aanvullende dataset 13). Pathway-verrijking voor kenmerken die verschilden tussen de twee datasets onthulde verwachte verschillen, zoals processen van vetzuur-β-oxidatie en ketonmetabolisme (langzame vezels), myofilament-/spiercontractie (respectievelijk snelle en langzame vezels) en koolhydraatkatabolisme (snelle vezels). De activiteit van serine/threonine-proteïnefosfatase was ook verhoogd in snelle vezels, gedreven door kenmerken zoals de regulerende en katalytische fosfatase-subeenheden (PPP3CB, PPP1R3D en PPP1R3A), waarvan bekend is dat ze het glycogeenmetabolisme reguleren (47) (Aanvullende figuren 8D-E). Andere pathways die verrijkt waren in snelle vezels omvatten verwerkingslichamen (P-lichamen) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) in het proteoom (Aanvullende figuur 8F), mogelijk betrokken bij post-transcriptionele regulatie (48), en transcriptiefactoractiviteit (SREBF1, RXRG, RORA) in het transcriptoom (Aanvullende figuur 8G). Langzame vezels waren verrijkt met oxidoreductase-activiteit (BDH1, DCXR, TXN2) (Aanvullende figuur 8H), amidebinding (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Aanvullende figuur 8I), extracellulaire matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Aanvullende figuur 8J) en receptor-ligandactiviteit (FNDC5, SPX, NENF) (Aanvullende figuur 8K).
Om meer inzicht te krijgen in de transcriptionele regulatie die ten grondslag ligt aan de kenmerken van langzame/snelle spiervezels, hebben we een transcriptiefactor-verrijkingsanalyse uitgevoerd met behulp van SCENIC49 (Aanvullende dataset 14). Veel transcriptiefactoren waren significant verrijkt tussen snelle en langzame spiervezels (Figuur 4E). Dit omvatte transcriptiefactoren zoals MAFA, die eerder in verband is gebracht met de ontwikkeling van snelle spiervezels,50 evenals verschillende transcriptiefactoren die nog niet eerder in verband zijn gebracht met spiervezeltype-specifieke genprogramma's. Onder deze transcriptiefactoren waren PITX1, EGR1 en MYF6 het meest verrijkt in snelle spiervezels (Figuur 4E). Daarentegen waren ZSCAN30 en EPAS1 (ook bekend als HIF2A) de meest verrijkte transcriptiefactoren in langzame spiervezels (Figuur 4E). In overeenstemming hiermee werd MAFA op hogere niveaus tot expressie gebracht in het UMAP-gebied dat overeenkomt met snelle spiervezels, terwijl EPAS1 het tegenovergestelde expressiepatroon vertoonde (Figuur 4F).
Naast bekende eiwitcoderende genen zijn er talloze niet-coderende RNA-biotypen die mogelijk betrokken zijn bij de regulatie van de menselijke ontwikkeling en ziekte. 51, 52 In transcriptoomdatasets vertonen verschillende niet-coderende RNA's vezeltypespecificiteit (Figuur 5A en Aanvullende Dataset 15), waaronder LINC01405, dat zeer specifiek is voor langzame vezels en waarvan is gerapporteerd dat het verlaagd is in spieren van patiënten met mitochondriale myopathie. 53 Daarentegen vertoont RP11-255P5.3, corresponderend met het lnc-ERCC5-5-gen (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, specificiteit voor snelle vezels. Zowel LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) als RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) vertonen specificiteit voor skeletspieren (aanvullende figuren 9A–B) en hebben geen bekende contractiele genen binnen hun genomische omgeving van 1 Mb. Dit suggereert dat ze een gespecialiseerde rol spelen bij het reguleren van vezeltypen in plaats van het reguleren van naburige contractiele genen. De langzame/snelle vezeltype-specifieke expressieprofielen van respectievelijk LINC01405 en RP11-255P5.3 werden bevestigd met behulp van RNAscope (figuren 5B–C).
A. Niet-coderende RNA-transcripten worden significant gereguleerd in langzame en snelle spiervezels. B. Representatieve RNAscope-afbeeldingen die de specificiteit voor langzame en snelle spiervezels van respectievelijk LINC01405 en RP11-255P5.3 laten zien. Schaalbalk = 50 μm. C. Kwantificering van de myofibertype-specifieke expressie van niet-coderend RNA zoals bepaald door RNAscope (n = 3 biopten van onafhankelijke individuen, waarbij snelle en langzame spiervezels binnen elk individu werden vergeleken). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een tweezijdige Student's t-test. Boxplots tonen de mediaan en het eerste en derde kwartiel, met snorren die wijzen naar de minimum- en maximumwaarden. D. De novo workflow voor de identificatie van microbiële eiwitten (gemaakt met BioRender.com). E. Het microbiële eiwit LINC01405_ORF408:17441:17358 wordt specifiek tot expressie gebracht in langzame skeletspiervezels (n=5 biopten van onafhankelijke deelnemers, waarbij snelle en langzame spiervezels bij elke deelnemer werden vergeleken). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de lineaire Limm-modelmethode in combinatie met een empirische Bayesiaanse benadering, gevolgd door de Benjamini-Hochberg-methode voor meervoudige vergelijkingen met p-waardecorrectie. Boxplots tonen de mediaan, het eerste en derde kwartiel, met snorren die wijzen naar de maximum-/minimumwaarden.
Recent onderzoek heeft aangetoond dat veel vermeende niet-coderende transcripten coderen voor getranscribeerde microbiële eiwitten, waarvan sommige de spierfunctie reguleren. 44, 55 Om microbiële eiwitten met potentiële vezeltypespecificiteit te identificeren, hebben we onze proteoomdataset van 1000 vezels doorzocht met behulp van een aangepast FASTA-bestand met de sequenties van niet-coderende transcripten (n = 305) die in de transcriptoomdataset van 1000 vezels werden gevonden (Figuur 5D). We identificeerden 197 microbiële eiwitten uit 22 verschillende transcripten, waarvan er 71 differentieel gereguleerd werden tussen langzame en snelle skeletspiervezels (Aanvullende figuur 9C en Aanvullende dataset 16). Voor LINC01405 werden drie microbiële eiwitproducten geïdentificeerd, waarvan er één een vergelijkbare specificiteit voor langzame vezels vertoonde als het transcript (Figuur 5E en Aanvullende figuur 9D). Zo identificeerden we LINC01405 als een gen dat codeert voor een microbieel eiwit dat specifiek is voor langzame skeletspiervezels.
We hebben een uitgebreide workflow ontwikkeld voor grootschalige proteomische karakterisering van individuele spiervezels en hebben regulatoren van vezelheterogeniteit in gezonde toestanden geïdentificeerd. We hebben deze workflow toegepast om te begrijpen hoe nemaline myopathieën de heterogeniteit van skeletspiervezels beïnvloeden. Nemaline myopathieën zijn erfelijke spierziekten die spierzwakte veroorzaken en bij getroffen kinderen gepaard gaan met een reeks complicaties, waaronder ademhalingsproblemen, scoliose en beperkte mobiliteit van de ledematen. 19,20 Bij nemaline myopathieën leiden pathogene varianten in genen zoals actine alfa 1 (ACTA1) doorgaans tot een overwicht aan langzame spiervezels, hoewel dit effect heterogeen is. Een opmerkelijke uitzondering is troponine T1 nemaline myopathie (TNNT1), die een overwicht aan snelle vezels heeft. Een beter begrip van de heterogeniteit die ten grondslag ligt aan de dysregulatie van skeletspiervezels die wordt waargenomen bij nemaline myopathieën, kan daarom helpen om de complexe relatie tussen deze ziekten en het spiervezeltype te ontrafelen.
Vergeleken met gezonde controles (n=3 per groep) vertoonden spiervezels geïsoleerd van patiënten met nemaline myopathie met mutaties in de ACTA1- en TNNT1-genen een duidelijke atrofie of dystrofie van de spiervezels (Figuur 6A, Aanvullende tabel 3). Dit leverde aanzienlijke technische uitdagingen op voor proteomische analyse vanwege de beperkte hoeveelheid beschikbaar materiaal. Desondanks konden we 2485 eiwitten detecteren in 272 skeletspiervezels. Na filtering op ten minste 1000 gekwantificeerde eiwitten per vezel werden 250 vezels onderworpen aan verdere bio-informatische analyse. Na filtering werden gemiddeld 1573 ± 359 eiwitten per vezel gekwantificeerd (Aanvullende figuur 10A, Aanvullende datasets 17-18). Opmerkelijk is dat, ondanks de significante afname van de vezelgrootte, de proteoomdiepte van de monsters van patiënten met nemaline myopathie slechts in geringe mate was afgenomen. Bovendien konden we door de verwerking van deze gegevens met behulp van onze eigen FASTA-bestanden (inclusief niet-coderende transcripten) vijf microbiële eiwitten identificeren in skeletspiervezels van patiënten met nemaline myopathie (Aanvullende gegevensset 19). Het dynamische bereik van het proteoom was aanzienlijk breder en de totale eiwitten in de controlegroep correleerden goed met de resultaten van een eerdere proteoomanalyse van 1000 vezels (Aanvullende figuur 10B-C).
A. Microscopische beelden die vezelatrofie of -dystrofie en de dominantie van verschillende vezeltypen op basis van MYH tonen bij ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën (NM). Schaalbalk = 100 μm. Om de reproduceerbaarheid van de kleuring bij ACTA1- en TNNT1-patiënten te garanderen, werden drie biopten van patiënten twee tot drie keer gekleurd (vier coupes per geval) voordat representatieve beelden werden geselecteerd. B. Vezeltypeproporties bij deelnemers op basis van MYH. C. Hoofdcomponentenanalyse (PCA)-plot van skeletspiervezels bij patiënten met nemaline myopathieën en controles. D. Skeletspiervezels van patiënten met nemaline myopathieën en controles geprojecteerd op een PCA-plot bepaald op basis van de 1000 vezels geanalyseerd in Figuur 2. Bijvoorbeeld vulkaanplots die de verschillen vergelijken tussen deelnemers met ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën en controles, en tussen deelnemers met ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën. Gekleurde cirkels geven eiwitten aan die significant verschillend waren bij π < 0,05, en donkere stippen geven eiwitten aan die significant verschillend waren bij FDR < 0,05. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de lineaire Limma-modelmethode en empirische Bayesiaanse methoden, gevolgd door p-waardecorrectie voor meervoudige vergelijkingen met behulp van de Benjamini-Hochberg-methode. H. Verrijkingsanalyse van significant differentieel tot expressie gebrachte eiwitten in het gehele proteoom en in type 1- en 2A-vezels. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het clusterProfiler-pakket en Benjamini-Hochberg-gecorrigeerde p-waarden. I, J. Hoofdcomponentenanalyse (PCA)-plots gekleurd op basis van extracellulaire matrix- en mitochondriale genontologie (GO)-termen.
Omdat nemaline myopathieën de verhouding van MYH-expressieve myofibertypen in skeletspieren kunnen beïnvloeden,19,20 hebben we eerst de MYH-expressieve myofibertypen onderzocht bij patiënten met nemaline myopathieën en controles. We bepaalden het myofibertype met behulp van een onbevooroordeelde methode die eerder is beschreven voor de 1000 myofiber-assay (aanvullende figuren 10D-E) en slaagden er wederom niet in om zuivere 2X-myofibers te identificeren (figuur 6B). We observeerden een heterogeen effect van nemaline myopathieën op het myofibertype, aangezien twee patiënten met ACTA1-mutaties een verhoogd aandeel type 1-myofibers hadden, terwijl twee patiënten met TNNT1-nemaline myopathie een verlaagd aandeel type 1-myofibers hadden (figuur 6B). De expressie van MYH2 en snelle troponine-isoformen (TNNC2, TNNI2 en TNNT3) was inderdaad verlaagd bij ACTA1-nemaline myopathieën, terwijl de expressie van MYH7 verlaagd was bij TNNT1-nemaline myopathieën (Aanvullende figuur 11A). Dit komt overeen met eerdere rapporten over heterogene myofiber-type-switching bij nemaline myopathieën.19,20 We bevestigden deze resultaten door middel van immunohistochemie en vonden dat patiënten met ACTA1-nemaline myopathie een overwicht hadden aan type 1-myofibers, terwijl patiënten met TNNT1-nemaline myopathie het tegenovergestelde patroon vertoonden (Figuur 6A).
Op het niveau van het proteoom van individuele spiervezels clusterden skeletspiervezels van patiënten met ACTA1- en TNNT1-nemalinemyopathie met de meeste controlevezels, waarbij de vezels van TNNT1-nemalinemyopathie over het algemeen het ernstigst waren aangetast (Figuur 6C). Dit was met name duidelijk bij het plotten van de principale componentenanalyse (PCA) van pseudo-opgeblazen vezels voor elke patiënt, waarbij patiënten 2 en 3 met TNNT1-nemalinemyopathie het verst verwijderd leken van de controlemonsters (Aanvullende figuur 11B, Aanvullende dataset 20). Om beter te begrijpen hoe vezels van myopathiepatiënten zich verhouden tot gezonde vezels, gebruikten we gedetailleerde informatie verkregen uit proteomische analyse van 1000 vezels van gezonde volwassen deelnemers. We projecteerden vezels uit de myopathie-dataset (ACTA1- en TNNT1-nemalinemyopathiepatiënten en controles) op de PCA-plot verkregen uit de proteomische analyse van 1000 vezels (Figuur 6D). De verdeling van MYH-vezeltypen langs PC2 in controlevezels was vergelijkbaar met de vezelverdeling verkregen uit de proteomische analyse van 1000 vezels. De meeste vezels bij patiënten met nemaline myopathie verschoven echter langs PC2, waardoor ze overlapten met gezonde snel samentrekkende vezels, ongeacht hun oorspronkelijke MYH-vezeltype. Hoewel patiënten met ACTA1-nemaline myopathie een verschuiving naar type 1-vezels vertoonden bij kwantificering met behulp van MYH-gebaseerde methoden, verschoven zowel ACTA1-nemaline myopathie als TNNT1-nemaline myopathie het proteoom van de skeletspiervezels naar snel samentrekkende vezels.
Vervolgens vergeleken we elke patiëntengroep rechtstreeks met gezonde controles en identificeerden we respectievelijk 256 en 552 differentieel tot expressie gebrachte eiwitten in ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën (Figuur 6E–G en Aanvullende Figuur 11C, Aanvullende Gegevensset 21). Genverrijkingsanalyse onthulde een gecoördineerde afname van mitochondriale eiwitten (Figuur 6H–I, Aanvullende Gegevensset 22). Verrassend genoeg was deze afname, ondanks de differentiële dominantie van vezeltypen in ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën, volledig onafhankelijk van het MYH-gebaseerde vezeltype (Figuur 6H en Aanvullende Figuren 11D–I, Aanvullende Gegevensset 23). Drie microbiële eiwitten werden ook gereguleerd in ACTA1- of TNNT1-nemaline myopathieën. Twee van deze microproteïnen, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ook bekend als LINC00598 of Lnc-FOXO1) en ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), vertoonden alleen een verschil in abundantie in type 1-spiervezels. Van ENSG00000215483_TR14_ORF67 is eerder gerapporteerd dat het een rol speelt bij de regulatie van de celcyclus. 56 Aan de andere kant was ENSG00000232046_TR1_ORF437 (overeenkomend met LINC01798) verhoogd in zowel type 1- als type 2A-spiervezels bij ACTA1-nemaline myopathie in vergelijking met gezonde controles (Aanvullende figuur 12A, Aanvullende dataset 24). Daarentegen werden ribosomale eiwitten grotendeels niet beïnvloed door nemaline myopathie, hoewel RPS17 wel verlaagd was in ACTA1 nemaline myopathie (Fig. 6E).
Verrijkingsanalyse bracht ook een opregulatie van immuunsysteemprocessen aan het licht bij ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën, terwijl celadhesie eveneens was toegenomen bij TNNT1-nemaline myopathie (Figuur 6H). De verrijking van deze extracellulaire factoren werd weerspiegeld door de extracellulaire matrixeiwitten die de PCA in PC1 en PC2 in negatieve richting verschoven (d.w.z. naar de meest aangetaste vezels) (Figuur 6J). Beide patiëntengroepen vertoonden een verhoogde expressie van extracellulaire eiwitten die betrokken zijn bij immuunreacties en sarcolemma-herstelmechanismen, zoals annexines (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 en hun interagerende eiwit S100A1159 (Aanvullende figuren 12B-C). Van dit proces is eerder gerapporteerd dat het versterkt is bij spierdystrofieën60, maar voor zover wij weten is het nog niet eerder in verband gebracht met nemaline myopathieën. Een normale werking van dit moleculaire mechanisme is vereist voor het herstel van het sarcolemma na letsel en voor de fusie van nieuw gevormde myocyten met spiervezels58,61. De verhoogde activiteit van dit proces in beide patiëntengroepen suggereert daarom een herstelreactie op letsel veroorzaakt door instabiliteit van de spiervezels.
De effecten van de verschillende nemaline myopathieën waren goed gecorreleerd (r = 0,736) en vertoonden een redelijke overlap (aanvullende figuren 11A-B), wat aangeeft dat ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën vergelijkbare effecten hebben op het proteoom. Sommige eiwitten werden echter alleen gereguleerd bij ACTA1- of TNNT1-nemaline myopathie (aanvullende figuren 11A en C). Het profibrotische eiwit MFAP4 was een van de meest opgereguleerde eiwitten bij TNNT1-nemaline myopathie, maar bleef onveranderd bij ACTA1-nemaline myopathie. SKIC8, een component van het PAF1C-complex dat verantwoordelijk is voor de regulatie van HOX-gen transcriptie, was neerwaarts gereguleerd bij TNNT1-nemaline myopathie, maar werd niet beïnvloed bij ACTA1-nemaline myopathie (aanvullende figuur 11A). Een directe vergelijking van ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathie toonde aan dat TNNT1-nemaline myopathie een grotere afname van mitochondriale eiwitten en een toename van eiwitten van het immuunsysteem vertoonde (Figuur 6G-H en aanvullende figuren 11C en 11H-I). Deze gegevens komen overeen met de grotere atrofie/dystrofie die werd waargenomen bij TNNT1-nemaline myopathie in vergelijking met TNNT1-nemaline myopathie (Figuur 6A), wat suggereert dat TNNT1-nemaline myopathie een ernstiger vorm van de ziekte vertegenwoordigt.
Om te beoordelen of de waargenomen effecten van nemaline myopathie aanhouden op het niveau van de gehele spier, hebben we een bulkproteomische analyse uitgevoerd van spierbiopten van hetzelfde cohort TNNT1-nemaline myopathiepatiënten en deze vergeleken met controles (n=3 per groep) (Aanvullende figuur 13A, Aanvullende dataset 25). Zoals verwacht waren de controles nauw verwant in de principale componentenanalyse, terwijl TNNT1-nemaline myopathiepatiënten een hogere variabiliteit tussen de monsters vertoonden, vergelijkbaar met die waargenomen in de analyse van individuele vezels (Aanvullende figuur 13B). De bulkanalyse reproduceerde de differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (Aanvullende figuur 13C, Aanvullende dataset 26) en biologische processen (Aanvullende figuur 13D, Aanvullende dataset 27) die werden benadrukt door de vergelijking van individuele vezels, maar verloor het vermogen om onderscheid te maken tussen verschillende vezeltypen en kon geen rekening houden met heterogene ziekte-effecten over de vezels heen.
Samengevat tonen deze gegevens aan dat proteomics van individuele spiervezels klinisch-biologische kenmerken kan onthullen die niet detecteerbaar zijn met gerichte methoden zoals immunoblotting. Bovendien benadrukken deze gegevens de beperkingen van het gebruik van actinevezeltypering (MYH) alleen om fenotypische adaptatie te beschrijven. Hoewel de vezeltypeverandering verschilt tussen actine- en troponine-nemaline myopathieën, ontkoppelen beide nemaline myopathieën de MYH-vezeltypering van het skeletspiervezelmetabolisme naar een sneller en minder oxidatief spierproteoom.
Cellulaire heterogeniteit is cruciaal voor weefsels om aan hun uiteenlopende behoeften te voldoen. In skeletspieren wordt dit vaak beschreven als vezeltypen die gekenmerkt worden door verschillende mate van krachtproductie en vermoeibaarheid. Het is echter duidelijk dat dit slechts een klein deel van de variabiliteit in skeletspiervezels verklaart, die veel variabeler, complexer en veelzijdiger is dan voorheen werd gedacht. Technologische vooruitgang heeft nu licht geworpen op de factoren die skeletspiervezels reguleren. Onze gegevens suggereren zelfs dat type 2X-vezels mogelijk geen apart subtype van skeletspiervezels vormen. Bovendien hebben we metabolische eiwitten, ribosomale eiwitten en celgebonden eiwitten geïdentificeerd als belangrijke bepalende factoren voor de heterogeniteit van skeletspiervezels. Door onze proteomische workflow toe te passen op patiëntmonsters met nematodenmyopathie, hebben we verder aangetoond dat MYH-gebaseerde vezeltypering de heterogeniteit van skeletspieren niet volledig weerspiegelt, vooral niet wanneer het systeem verstoord is. Ongeacht het MYH-gebaseerde vezeltype resulteert nematodenmyopathie namelijk in een verschuiving naar snellere en minder oxidatieve vezels.
Skeletspiervezels worden al sinds de 19e eeuw geclassificeerd. Recente omics-analyses hebben ons in staat gesteld de expressieprofielen van verschillende MYH-vezeltypen en hun reacties op verschillende stimuli te begrijpen. Zoals hier beschreven, hebben omics-benaderingen ook het voordeel dat ze gevoeliger zijn voor het kwantificeren van vezeltype-markers dan traditionele op antilichamen gebaseerde methoden, zonder afhankelijk te zijn van de kwantificering van één (of enkele) markers om een skeletspiervezeltype te definiëren. We gebruikten complementaire transcriptomische en proteomische workflows en integreerden de resultaten om de transcriptionele en post-transcriptionele regulatie van vezelheterogeniteit in menselijke skeletspiervezels te onderzoeken. Deze workflow resulteerde erin dat er geen zuivere 2X-vezels op eiwitniveau werden geïdentificeerd in de vastus lateralis van onze cohort gezonde jonge mannen. Dit is consistent met eerdere studies naar individuele vezels die minder dan 1% zuivere 2X-vezels vonden in een gezonde vastus lateralis, hoewel dit in de toekomst in andere spieren bevestigd moet worden. De discrepantie tussen de detectie van bijna zuivere 2X-vezels op mRNA-niveau en slechts gemengde 2A/2X-vezels op eiwitniveau is raadselachtig. De mRNA-expressie van MYH-isoformen is niet circadiaans,67 wat suggereert dat we het MYH2-signaal in ogenschijnlijk zuivere 2X-vezels op RNA-niveau waarschijnlijk niet hebben "gemist". Een mogelijke verklaring, hoewel puur hypothetisch, zou kunnen liggen in verschillen in eiwit- en/of mRNA-stabiliteit tussen MYH-isoformen. Geen enkele snelle vezel is immers 100% zuiver voor een MYH-isoform, en het is onduidelijk of MYH1-mRNA-expressieniveaus in het bereik van 70-90% zouden resulteren in een gelijke hoeveelheid MYH1 en MYH2 op eiwitniveau. Echter, wanneer het gehele transcriptoom of proteoom wordt beschouwd, kan clusteranalyse met zekerheid slechts twee afzonderlijke clusters identificeren die langzame en snelle skeletspiervezels vertegenwoordigen, ongeacht hun precieze MYH-samenstelling. Dit is consistent met analyses met behulp van single-nucleus transcriptomische benaderingen, die doorgaans slechts twee afzonderlijke myonucleaire clusters identificeren. 68, 69, 70 Bovendien, hoewel eerdere proteomische studies type 2X-vezels hebben geïdentificeerd, clusteren deze vezels niet afzonderlijk van de rest van de snelle vezels en vertonen ze slechts een klein aantal differentieel overvloedige eiwitten in vergelijking met andere vezeltypen op basis van MYH. 14 Deze resultaten suggereren dat we moeten terugkeren naar de visie van begin 20e eeuw op de classificatie van spiervezels, die menselijke skeletspiervezels niet in drie afzonderlijke klassen verdeelde op basis van MYH, maar in twee clusters op basis van hun metabolische en contractiele eigenschappen. 63
Belangrijker nog is dat de heterogeniteit van spiervezels vanuit meerdere perspectieven moet worden bekeken. Eerdere "omics"-studies hebben in deze richting gewezen en gesuggereerd dat skeletspiervezels geen discrete clusters vormen, maar langs een continuüm zijn gerangschikt. 11, 13, 14, 64, 71 Hier laten we zien dat spiervezels, naast verschillen in contractiele en metabolische eigenschappen van skeletspieren, ook kunnen worden onderscheiden door kenmerken die verband houden met cel-celinteracties en translatieprocessen. We vonden inderdaad ribosomale heterogeniteit in skeletspiervezels die bijdraagt aan heterogeniteit, onafhankelijk van het type langzame en snelle vezels. De onderliggende oorzaak van deze substantiële heterogeniteit van spiervezels, onafhankelijk van het type langzame en snelle vezels, blijft onduidelijk, maar het kan wijzen op een gespecialiseerde ruimtelijke organisatie binnen spierbundels die optimaal reageren op specifieke krachten en belastingen,72 gespecialiseerde cellulaire of orgaanspecifieke communicatie met andere celtypen in de spiermicroomgeving73,74,75 of verschillen in ribosoomactiviteit binnen individuele spiervezels. Ribosomale heteroplasmie, hetzij door paraloge substitutie van RPL3 en RPL3L, hetzij op het niveau van 2'-O-methylering van rRNA, blijkt inderdaad geassocieerd te zijn met hypertrofie van de skeletspieren76,77. Multi-omische en ruimtelijke toepassingen, gecombineerd met functionele karakterisering van individuele spiervezels, zullen ons begrip van de spierbiologie op multi-omisch niveau verder bevorderen78.
Door de proteomen van individuele spiervezels van patiënten met nemaline myopathieën te analyseren, hebben we ook het nut, de effectiviteit en de toepasbaarheid van proteomics van individuele spiervezels aangetoond om de klinische pathofysiologie van skeletspieren op te helderen. Bovendien konden we, door onze workflow te vergelijken met globale proteomische analyse, aantonen dat proteomics van individuele spiervezels dezelfde diepgang aan informatie oplevert als globale weefselproteomics en deze diepgang vergroot door rekening te houden met intervezelheterogeniteit en spiervezeltype. Naast de verwachte (zij het variabele) verschillen in vezeltypeverhouding die werden waargenomen bij ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën in vergelijking met gezonde controles,19 observeerden we ook oxidatieve en extracellulaire remodellering onafhankelijk van MYH-gemedieerde vezeltype-omschakeling. Fibrose is eerder gerapporteerd bij TNNT1-nemaline myopathieën.19 Onze analyse bouwt echter voort op deze bevinding door ook verhoogde niveaus van extracellulair afgescheiden stressgerelateerde eiwitten, zoals annexinen, die betrokken zijn bij sarcolemma-herstelmechanismen, aan te tonen in spiervezels van patiënten met ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathieën.57,58,59 Concluderend kan gesteld worden dat verhoogde annexineniveaus in spiervezels van patiënten met nemaline myopathie een cellulaire respons kunnen zijn om ernstig atrofische spiervezels te herstellen.
Hoewel deze studie de grootste single-fiber whole-muscle-omics-analyse van menselijke spieren tot nu toe vertegenwoordigt, kent ze wel beperkingen. We isoleerden skeletspiervezels uit een relatief kleine en homogene steekproef van deelnemers en één enkele spier (de vastus lateralis). Daarom is het onmogelijk om het bestaan van specifieke vezelpopulaties in verschillende spiertypen en bij extreme spierfysiologie uit te sluiten. We kunnen bijvoorbeeld niet uitsluiten dat een subgroep van ultrasnelle vezels (bijvoorbeeld pure 2X-vezels) ontstaat bij zeer getrainde sprinters en/of krachtsporters79 of tijdens perioden van spierinactiviteit66,80. Bovendien verhinderde de beperkte steekproefomvang ons om sekseverschillen in vezelheterogeniteit te onderzoeken, aangezien bekend is dat de verhoudingen van vezeltypen verschillen tussen mannen en vrouwen. Verder konden we geen transcriptomische en proteomische analyses uitvoeren op dezelfde spiervezels of monsters van dezelfde deelnemers. Naarmate wij en anderen de analyses van individuele cellen en spiervezels blijven optimaliseren met behulp van omics-analyse om een ultralage monsterinput te bereiken (zoals hier aangetoond in de analyse van vezels van patiënten met mitochondriale myopathie), wordt de mogelijkheid om multi-omics (en functionele) benaderingen binnen individuele spiervezels te combineren steeds duidelijker.
Over het geheel genomen identificeren en verklaren onze gegevens de transcriptionele en post-transcriptionele drijfveren van de heterogeniteit van skeletspieren. In het bijzonder presenteren we gegevens die een lang bestaand dogma in de skeletspierfysiologie, geassocieerd met de klassieke MYH-gebaseerde definitie van vezeltypen, ter discussie stellen. We hopen het debat nieuw leven in te blazen en uiteindelijk ons begrip van de classificatie en heterogeniteit van skeletspiervezels te herzien.
Veertien blanke deelnemers (12 mannen en 2 vrouwen) stemden er vrijwillig mee in om aan dit onderzoek deel te nemen. Het onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Gent (BC-10237), voldeed aan de Verklaring van Helsinki van 2013 en werd geregistreerd op ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Algemene kenmerken van de deelnemers worden gepresenteerd in Aanvullende Tabel 1. Na het verkrijgen van mondelinge en schriftelijke toestemming ondergingen de deelnemers een medisch onderzoek voordat ze definitief in het onderzoek werden opgenomen. De deelnemers waren jong (22-42 jaar), gezond (geen medische aandoeningen, geen rookgeschiedenis) en matig fysiek actief. De maximale zuurstofopname werd bepaald met behulp van een step-ergometer voor het beoordelen van de fysieke fitheid, zoals eerder beschreven. 81
Spierbiopsieën werden driemaal afgenomen in rust en in nuchtere toestand, met een tussenpoos van 14 dagen. Omdat deze monsters werden afgenomen als onderdeel van een grotere studie, consumeerden de deelnemers 40 minuten vóór de biopsie een placebo (lactose), een H1-receptorantagonist (540 mg fexofenadine) of een H2-receptorantagonist (40 mg famotidine). We hebben eerder aangetoond dat deze histamine-receptorantagonisten geen invloed hebben op de conditie van de skeletspieren in rust⁸¹ en er werd geen toestandgerelateerde clustering waargenomen in onze kwaliteitscontroleplots (aanvullende figuren 3 en 6). Een gestandaardiseerd dieet (41,4 kcal/kg lichaamsgewicht, 5,1 g/kg lichaamsgewicht koolhydraten, 1,4 g/kg lichaamsgewicht eiwitten en 1,6 g/kg lichaamsgewicht vet) werd gedurende 48 uur vóór elke experimentele dag aangehouden, en een gestandaardiseerd ontbijt (1,5 g/kg lichaamsgewicht koolhydraten) werd 's ochtends op de experimentele dag geconsumeerd. Onder lokale verdoving (0,5 ml 1% lidocaïne zonder adrenaline) werden spierbiopsieën afgenomen van de vastus lateralis-spier met behulp van percutane Bergström-aspiratie.82 De spiermonsters werden onmiddellijk ingebed in RNAlater en bewaard bij 4 °C tot de handmatige dissectie van de vezels (maximaal 3 dagen).
Vers geïsoleerde spiervezelbundels werden overgebracht naar vers RNAlater-medium in een kweekbakje. Individuele spiervezels werden vervolgens handmatig gedissecteerd met behulp van een stereomicroscoop en een fijne pincet. Vijfentwintig vezels werden uit elk biopt gedissecteerd, waarbij speciale aandacht werd besteed aan het selecteren van vezels uit verschillende delen van het biopt. Na dissectie werd elke vezel voorzichtig ondergedompeld in 3 μl lysisbuffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) met daarin de enzymen proteinase K en DNase om ongewenste eiwitten en DNA te verwijderen. Cellysis en verwijdering van eiwitten/DNA werden vervolgens geïnitieerd door kort te vortexen, de vloeistof te centrifugeren in een microcentrifuge en te incuberen bij kamertemperatuur (10 min). Het lysaat werd vervolgens geïncubeerd in een thermocycler (T100, Bio-Rad) bij 37°C gedurende 5 min, bij 75°C gedurende 5 min en daarna onmiddellijk bewaard bij -80°C tot verdere verwerking.
Illumina-compatibele polyadenyleerde RNA-bibliotheken werden bereid uit 2 µl myofiberlysaat met behulp van de QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Gedetailleerde methoden zijn te vinden in de handleiding van de fabrikant. Het proces begint met de synthese van eerstestreng-cDNA door middel van reverse transcriptie, waarbij unieke moleculaire identificatoren (UMI's) en monsterspecifieke i1-barcodes worden geïntroduceerd om het samenvoegen van monsters te garanderen en technische variabiliteit tijdens de verdere verwerking te verminderen. cDNA van 96 myofibers wordt vervolgens samengevoegd en gezuiverd met magnetische kralen, waarna RNA wordt verwijderd en tweedestrengsynthese wordt uitgevoerd met behulp van willekeurige primers. De bibliotheek wordt gezuiverd met magnetische kralen, poolspecifieke i5/i7-tags worden toegevoegd en PCR-geamplificeerd. Een laatste zuiveringsstap levert Illumina-compatibele bibliotheken op. De kwaliteit van elke bibliotheekpool werd beoordeeld met behulp van de High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Op basis van Qubit-kwantificatie werden de pools verder samengevoegd tot equimolaire concentraties (2 nM). De resulterende pool werd vervolgens gesequenced op een NovaSeq 6000-instrument in standaardmodus met behulp van de NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotiden) met een belading van 2 nM (4% PhiX).
Onze pipeline is gebaseerd op de data-analysepipeline van Lexogen's QuantSeq Pool (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). De data werden eerst gedemultiplext met bcl2fastq2 (v2.20.0) op basis van de i7/i5-index. Read 2 werd vervolgens gedemultiplext met idemux (v0.1.6) op basis van de i1-samplebarcode en UMI-sequenties werden geëxtraheerd met umi_tools (v1.0.1). De reads werden vervolgens in meerdere rondes getrimd met cutadapt (v3.4) om korte reads (<20 basenparen) of reads die uitsluitend uit adaptersequenties bestonden te verwijderen. De reads werden vervolgens uitgelijnd met het menselijk genoom met behulp van STAR (v2.6.0c) en de BAM-bestanden werden geïndexeerd met SAMtools (v1.11). Dubbele reads werden verwijderd met umi_tools (v1.0.1). Ten slotte werd het tellen van de alignments uitgevoerd met behulp van featureCounts in Subread (v2.0.3). Kwaliteitscontrole werd uitgevoerd met FastQC (v0.11.9) in verschillende tussenliggende fasen van de pipeline.
Alle verdere bioinformatische verwerking en visualisatie werden uitgevoerd in R (v4.2.3), voornamelijk met behulp van de Seurat (v4.4.0) workflow. 83 Daarom werden individuele UMI-waarden en metadatamatrices omgezet in Seurat-objecten. Genen die in minder dan 30% van alle vezels tot expressie kwamen, werden verwijderd. Monsters van lage kwaliteit werden verwijderd op basis van een minimale drempel van 1000 UMI-waarden en 1000 gedetecteerde genen. Uiteindelijk doorstonden 925 vezels alle kwaliteitscontrole-filterstappen. UMI-waarden werden genormaliseerd met behulp van de Seurat SCTransform v2-methode, 84 inclusief alle 7418 gedetecteerde kenmerken, en verschillen tussen deelnemers werden eruit geregresseerd. Alle relevante metadata zijn te vinden in Aanvullende Dataset 28.
Geplaatst op: 10 september 2025