Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt heeft beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste resultaten raden wij u aan een nieuwere browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om voortdurende ondersteuning te garanderen, zullen we de site in de tussentijd weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Het opzetten van diermodellen voor modische verandering (MC) is een belangrijke basis voor het bestuderen van MC. Vierenvijftig Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden verdeeld in een schijnoperatiegroep, een spierimplantatiegroep (ME-groep) en een nucleus pulposus-implantatiegroep (NPE-groep). In de NPE-groep werd de tussenwervelschijf blootgelegd door een anterolaterale lumbale chirurgische benadering en werd een naald gebruikt om het L5-wervellichaam nabij de eindplaat te doorboren. NP werd met een injectiespuit uit de tussenwervelschijf L1/2 geëxtraheerd en daarin geïnjecteerd. Een gat boren in het subchondrale bot. De chirurgische procedures en boormethoden in de spierimplantatiegroep en de schijnoperatiegroep waren dezelfde als die in de NP-implantatiegroep. Bij de ME-groep werd een stukje spier in het gaatje geplaatst, terwijl bij de schijnoperatiegroep niets in het gaatje werd geplaatst. Na de operatie werden MRI-scans en moleculair biologische tests uitgevoerd. Het signaal in de NPE-groep veranderde, maar er was geen duidelijke signaalverandering in de schijnoperatiegroep en de ME-groep. Histologische observatie toonde aan dat abnormale weefselproliferatie werd waargenomen op de implantatieplaats, en dat de expressie van IL-4, IL-17 en IFN-y was verhoogd in de NPE-groep. Implantatie van NP in het subchondrale bot kan een diermodel van MC vormen.
Modische veranderingen (MC) zijn laesies van de werveleindplaten en het aangrenzende beenmerg die zichtbaar zijn op magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Ze komen vrij vaak voor bij personen met bijbehorende symptomen1. Veel onderzoeken hebben het belang van MC benadrukt vanwege de associatie ervan met lage rugpijn (LRP)2,3. de Roos et al.4 en Modic et al.5 beschreven onafhankelijk van elkaar eerst drie verschillende soorten subchondrale signaalafwijkingen in het wervelbeenmerg. Modische type I-veranderingen zijn hypointense op T1-gewogen (T1W) sequenties en hyperintense op T2-gewogen (T2W) sequenties. Deze laesie onthult fissuur-eindplaten en aangrenzend vasculair granulatieweefsel in het beenmerg. Modische type II-veranderingen vertonen een hoog signaal op zowel T1W- als T2W-sequenties. Bij dit type laesie kan vernietiging van de eindplaat worden aangetroffen, evenals histologische vetvervanging van het aangrenzende beenmerg. Modische type III-veranderingen vertonen een laag signaal in T1W- en T2W-sequenties. Er zijn sclerotische laesies waargenomen die overeenkomen met de eindplaten6. MC wordt beschouwd als een pathologische ziekte van de wervelkolom en is nauw verbonden met veel degeneratieve ziekten van de wervelkolom7,8,9.
Gezien de beschikbare gegevens hebben verschillende onderzoeken gedetailleerde inzichten opgeleverd in de etiologie en pathologische mechanismen van MC. Albert et al. suggereerde dat MC veroorzaakt kan worden door een hernia8. Hu et al. schreef MC toe aan ernstige schijfdegeneratie10. Kroc stelde het concept van 'interne schijfruptuur' voor, wat stelt dat herhaaldelijk schijftrauma kan leiden tot microscheuren in de eindplaat. Na gespleten vorming kan vernietiging van de eindplaat door de nucleus pulposus (NP) een auto-immuunreactie veroorzaken, wat verder leidt tot de ontwikkeling van MC11. Ma et al. deelde een soortgelijk standpunt en rapporteerde dat NP-geïnduceerde auto-immuniteit een sleutelrol speelt in de pathogenese van MC12.
Cellen van het immuunsysteem, vooral CD4+ T-helperlymfocyten, spelen een cruciale rol in de pathogenese van auto-immuniteit13. De onlangs ontdekte Th17-subset produceert het pro-inflammatoire cytokine IL-17, bevordert de chemokine-expressie en stimuleert T-cellen in beschadigde organen om IFN-γ14 te produceren. Th2-cellen spelen ook een unieke rol in de pathogenese van immuunreacties. Expressie van IL-4 als een representatieve Th2-cel kan tot ernstige immunopathologische gevolgen leiden15.
Hoewel er veel klinische onderzoeken zijn uitgevoerd naar MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, is er nog steeds een gebrek aan geschikte dierexperimentele modellen die het MC-proces kunnen nabootsen dat vaak bij mensen voorkomt en kan worden uitgevoerd. gebruikt om de etiologie of nieuwe behandelingen zoals gerichte therapie te onderzoeken. Tot op heden zijn slechts enkele diermodellen van MC gerapporteerd om de onderliggende pathologische mechanismen te bestuderen.
Gebaseerd op de auto-immuuntheorie voorgesteld door Albert en Ma, heeft deze studie een eenvoudig en reproduceerbaar MC-model van konijnen tot stand gebracht door NP automatisch te transplanteren nabij de geboorde werveleindplaat. Andere doelstellingen zijn het observeren van de histologische kenmerken van de diermodellen en het evalueren van de specifieke mechanismen van NP bij de ontwikkeling van MC. Daartoe gebruiken we technieken zoals moleculaire biologie, MRI en histologische studies om de progressie van MC te bestuderen.
Twee konijnen stierven door bloedingen tijdens de operatie, en vier konijnen stierven tijdens anesthesie tijdens MRI. De overige 48 konijnen overleefden en vertoonden na de operatie geen gedrags- of neurologische symptomen.
MRI laat zien dat de signaalintensiteit van het ingebedde weefsel in verschillende gaten verschillend is. De signaalintensiteit van het L5-wervellichaam in de NPE-groep veranderde geleidelijk na 12, 16 en 20 weken na het inbrengen (de T1W-sequentie vertoonde een laag signaal en de T2W-sequentie vertoonde een gemengd signaal plus een laag signaal) (Fig. 1C), terwijl de MRI lijkt van de andere twee groepen ingebedde delen bleven relatief stabiel gedurende dezelfde periode (Fig. 1A, B).
(A) Representatieve sequentiële MRI's van de lumbale wervelkolom van het konijn op 3 tijdstippen. Op de beelden van de schijnoperatiegroep werden geen signaalafwijkingen gevonden. (B) De signaalkarakteristieken van het wervellichaam in de ME-groep zijn vergelijkbaar met die in de schijnoperatiegroep, en er wordt in de loop van de tijd geen significante signaalverandering waargenomen op de inbeddingsplaats. (C) In de NPE-groep is het lage signaal duidelijk zichtbaar in de T1W-reeks, en zijn het gemengde signaal en het lage signaal duidelijk zichtbaar in de T2W-reeks. Vanaf de periode van 12 weken tot de periode van 20 weken nemen de sporadische hoge signalen rond de lage signalen in de T2W-reeks af.
Duidelijke bothyperplasie kan worden gezien op de implantatieplaats van het wervellichaam in de NPE-groep, en de bothyperplasie treedt sneller op tussen 12 en 20 weken (Fig. 2C) vergeleken met de NPE-groep. Er wordt geen significante verandering waargenomen in de gemodelleerde wervellichamen. lichamen; Schijngroep en ME-groep (Fig. 2C) 2A, B).
(A) Het oppervlak van het wervellichaam bij het geïmplanteerde deel is zeer glad, het gat geneest goed en er is geen hyperplasie in het wervellichaam. (B) De vorm van de geïmplanteerde plek in de ME-groep is vergelijkbaar met die in de schijnoperatiegroep, en er is geen duidelijke verandering in het uiterlijk van de geïmplanteerde plek in de loop van de tijd. (C) Bothyperplasie trad op op de geïmplanteerde plaats in de NPE-groep. De bothyperplasie nam snel toe en breidde zich zelfs uit via de tussenwervelschijf naar het contralaterale wervellichaam.
Histologische analyse biedt meer gedetailleerde informatie over botvorming. Figuur 3 toont de foto's van de postoperatieve coupes gekleurd met H&E. In de schijnoperatiegroep waren de chondrocyten goed gerangschikt en werd er geen celproliferatie gedetecteerd (Fig. 3A). De situatie in de ME-groep was vergelijkbaar met die in de schijnoperatiegroep (Fig. 3B). In de NPE-groep werd echter een groot aantal chondrocyten en proliferatie van NP-achtige cellen waargenomen op de implantatieplaats (Fig. 3C);
(A) Trabeculae zijn te zien nabij de eindplaat, de chondrocyten zijn netjes gerangschikt met uniforme celgrootte en -vorm en geen proliferatie (40 keer). (B) De toestand van de implantatieplaats in de ME-groep is vergelijkbaar met die van de schijngroep. Trabeculae en chondrocyten zijn zichtbaar, maar er is geen duidelijke proliferatie op de implantatieplaats (40 keer). (B) Het is te zien dat chondrocyten en NP-achtige cellen aanzienlijk prolifereren, en dat de vorm en grootte van chondrocyten ongelijk zijn (40 keer).
De expressie van interleukine 4 (IL-4) mRNA, interleukine 17 (IL-17) mRNA en interferon γ (IFN-γ) mRNA werd waargenomen in zowel de NPE- als de ME-groep. Toen de expressieniveaus van doelgenen werden vergeleken, waren de genexpressies van IL-4, IL-17 en IFN-γ significant verhoogd in de NPE-groep vergeleken met die van de ME-groep en de schijnoperatiegroep (Fig. 4). (P <0,05). Vergeleken met de schijnoperatiegroep namen de expressieniveaus van IL-4, IL-17 en IFN-γ in de ME-groep slechts licht toe en bereikten geen statistische verandering (P > 0,05).
De mRNA-expressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ in de NPE-groep vertoonde een significant hogere trend dan die in de schijnoperatiegroep en de ME-groep (P <0,05).
Daarentegen vertoonden de expressieniveaus in de ME-groep geen significant verschil (P>0,05).
Western blot-analyse werd uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen tegen IL-4 en IL-17 om het veranderde mRNA-expressiepatroon te bevestigen. Zoals getoond in Figuren 5A,B waren de eiwitniveaus van IL-4 en IL-17 in de NPE-groep, vergeleken met de ME-groep en de schijnoperatiegroep, significant verhoogd (P <0,05). Vergeleken met de schijnoperatiegroep slaagden de eiwitniveaus van IL-4 en IL-17 in de ME-groep er ook niet in om statistisch significante veranderingen te bereiken (P> 0,05).
(A) De eiwitniveaus van IL-4 en IL-17 in de NPE-groep waren significant hoger dan die in de ME-groep en de placebogroep (P <0,05). (B) Western-blot-histogram.
Vanwege het beperkte aantal menselijke monsters dat tijdens de operatie wordt verkregen, zijn duidelijke en gedetailleerde onderzoeken naar de pathogenese van MC enigszins moeilijk. We hebben geprobeerd een diermodel van MC op te stellen om de potentiële pathologische mechanismen ervan te bestuderen. Tegelijkertijd werden radiologische evaluatie, histologische evaluatie en moleculair biologische evaluatie gebruikt om het beloop te volgen van MC geïnduceerd door NP autotransplantaat. Als gevolg hiervan resulteerde het NP-implantatiemodel in een geleidelijke verandering in de signaalintensiteit van tijdstippen van 12 weken naar 20 weken (gemengd laag signaal in T1W-sequenties en laag signaal in T2W-sequenties), wat wijst op weefselveranderingen en de histologische en moleculaire veranderingen. biologische evaluaties bevestigden de resultaten van het radiologische onderzoek.
De resultaten van dit experiment laten zien dat visuele en histologische veranderingen optraden op de plaats van inbreuk op het wervellichaam in de NPE-groep. Tegelijkertijd werd de expressie van IL-4-, IL-17- en IFN-γ-genen, evenals IL-4, IL-17 en IFN-γ waargenomen, wat erop wijst dat de schending van autoloog nucleus pulposus-weefsel in de wervels lichaam kan een reeks signaal- en morfologische veranderingen veroorzaken. Het is gemakkelijk te ontdekken dat de signaalkarakteristieken van de wervellichamen van het diermodel (laag signaal in de T1W-sequentie, gemengd signaal en laag signaal in de T2W-sequentie) zeer vergelijkbaar zijn met die van menselijke wervelcellen, en dat de MRI-karakteristieken ook bevestigen de observaties van histologie en grove anatomie, dat wil zeggen dat de veranderingen in de cellen van het wervellichaam progressief zijn. Hoewel de ontstekingsreactie veroorzaakt door acuut trauma kort na de punctie kan optreden, toonden de MRI-resultaten aan dat progressief toenemende signaalveranderingen 12 weken na de punctie optraden en tot 20 weken aanhielden zonder enig teken van herstel of ongedaanmaking van de MRI-veranderingen. Deze resultaten suggereren dat autologe vertebrale NP een betrouwbare methode is voor het vaststellen van progressieve MV bij konijnen.
Dit punctiemodel vereist voldoende vaardigheden, tijd en chirurgische inspanning. Bij voorbereidende experimenten kan dissectie of overmatige stimulatie van de paravertebrale ligamenteuze structuren resulteren in de vorming van vertebrale osteofyten. Er moet voor worden gezorgd dat de aangrenzende schijven niet worden beschadigd of geïrriteerd. Omdat de penetratiediepte moet worden gecontroleerd om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, hebben we handmatig een plug gemaakt door de huls van een 3 mm lange naald af te snijden. Het gebruik van deze plug zorgt voor een uniforme boordiepte in het wervellichaam. In voorlopige experimenten ontdekten drie orthopedisch chirurgen die bij de operatie betrokken waren dat 16-gauge naalden gemakkelijker te gebruiken waren dan 18-gauge naalden of andere methoden. Om overmatig bloeden tijdens het boren te voorkomen, zorgt het een tijdje stilhouden van de naald voor een geschikter insteekgat, wat erop wijst dat op deze manier een bepaalde mate van MC kan worden gecontroleerd.
Hoewel veel onderzoeken zich op MC hebben gericht, is er weinig bekend over de etiologie en pathogenese van MC25,26,27. Op basis van onze eerdere onderzoeken hebben we ontdekt dat auto-immuniteit een sleutelrol speelt bij het optreden en de ontwikkeling van MC12. Deze studie onderzocht de kwantitatieve expressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ, de belangrijkste differentiatieroutes van CD4+-cellen na antigeenstimulatie. In onze studie had de NPE-groep, vergeleken met de negatieve groep, een hogere expressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ, en waren de eiwitniveaus van IL-4 en IL-17 ook hoger.
Klinisch gezien is de expressie van IL-17-mRNA verhoogd in NP-cellen van patiënten met hernia28. Verhoogde IL-4- en IFN-γ-expressieniveaus werden ook gevonden in een acuut niet-compressief herniamodel vergeleken met gezonde controles29. IL-17 speelt een sleutelrol bij ontstekingen en weefselbeschadiging bij auto-immuunziekten30 en versterkt de immuunrespons op IFN-γ31. Verbeterde door IL-17 gemedieerde weefselbeschadiging is gemeld bij MRL/lpr-muizen32 en auto-immuniteitsgevoelige muizen33. IL-4 kan de expressie van pro-inflammatoire cytokines (zoals IL-1β en TNFα) en macrofaagactivering remmen34. Er werd gerapporteerd dat de mRNA-expressie van IL-4 verschillend was in de NPE-groep vergeleken met IL-17 en IFN-γ op hetzelfde tijdstip; De mRNA-expressie van IFN-γ in de NPE-groep was significant hoger dan die in de andere groepen. Daarom kan de productie van IFN-γ een mediator zijn van de ontstekingsreactie die wordt geïnduceerd door NP-intercalatie. Studies hebben aangetoond dat IFN-γ wordt geproduceerd door meerdere celtypen, waaronder geactiveerde type 1 helper-T-cellen, natural killer-cellen en macrofagen35,36, en een belangrijk pro-inflammatoir cytokine is dat de immuunrespons bevordert37.
Deze studie suggereert dat auto-immuunrespons mogelijk betrokken is bij het optreden en de ontwikkeling van MC. Luoma et al. ontdekte dat de signaalkarakteristieken van MC en prominente NP vergelijkbaar zijn op MRI, en beide een hoog signaal vertonen in de T2W-sequentie . Er is bevestigd dat sommige cytokinen nauw verband houden met het optreden van MC, zoals IL-139. Ma et al. suggereerde dat het opwaartse of neerwaartse uitsteeksel van NP een grote invloed kan hebben op het optreden en de ontwikkeling van MC12. Bobechko40 en Herzbein et al.41 rapporteerden dat NP een immunotolerant weefsel is dat vanaf de geboorte niet in de vasculaire circulatie kan komen. NP-uitsteeksels introduceren vreemde lichamen in de bloedtoevoer, waardoor lokale auto-immuunreacties worden bemiddeld42. Auto-immuunreacties kunnen een groot aantal immuunfactoren induceren, en wanneer deze factoren continu aan weefsels worden blootgesteld, kunnen ze veranderingen in de signalering veroorzaken43. In deze studie zijn overexpressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ typische immuunfactoren, wat de nauwe relatie tussen NP en MCs verder bewijst. Dit diermodel bootst de doorbraak van de NP en het binnendringen in de eindplaat goed na. Dit proces onthulde verder de impact van auto-immuniteit op MC.
Zoals verwacht biedt dit diermodel ons een mogelijk platform om MC te bestuderen. Dit model heeft echter nog steeds enkele beperkingen: ten eerste moeten sommige konijnen in de tussenfase worden geëuthanaseerd voor histologisch en moleculair biologisch onderzoek, waardoor sommige dieren na verloop van tijd ‘buiten gebruik raken’. Ten tweede: hoewel er in dit onderzoek drie tijdstippen zijn vastgesteld, hebben we helaas slechts één type MC gemodelleerd (Modic type I-verandering), dus het is niet voldoende om het ontwikkelingsproces van ziekten bij de mens weer te geven, en er moeten meer tijdstippen worden ingesteld. beter alle signaalveranderingen observeren. Ten derde kunnen de veranderingen in de weefselstructuur inderdaad duidelijk worden aangetoond door histologische kleuring, maar sommige gespecialiseerde technieken kunnen de microstructurele veranderingen in dit model beter onthullen. Er werd bijvoorbeeld gepolariseerd lichtmicroscopie gebruikt om de vorming van vezelkraakbeen in de tussenwervelschijven van konijnen te analyseren45. De langetermijneffecten van NP op MC en eindplaat vereisen verder onderzoek.
Vierenvijftig mannelijke witte Nieuw-Zeelandse konijnen (gewicht ongeveer 2,5-3 kg, leeftijd 3-3,5 maanden) werden willekeurig verdeeld in een schijnoperatiegroep, een spierimplantatiegroep (ME-groep) en een zenuwwortelimplantatiegroep (NPE-groep). Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het Tianjin-ziekenhuis en de experimentele methoden werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen.
Er zijn enkele verbeteringen aangebracht aan de chirurgische techniek van S. Sobajima 46 . Elk konijn werd in een laterale ligpositie geplaatst en het voorste oppervlak van vijf opeenvolgende lumbale tussenwervelschijven (IVD's) werd blootgelegd met behulp van een posterolaterale retroperitoneale benadering. Elk konijn kreeg algemene anesthesie (20% urethaan, 5 ml/kg via de oorader). Er werd een longitudinale incisie in de huid gemaakt vanaf de onderrand van de ribben tot aan de bekkenrand, 2 cm ventraal van de paravertebrale spieren. De rechter anterolaterale wervelkolom van L1 tot L6 werd blootgelegd door scherpe en stompe dissectie van het bovenliggende subcutane weefsel, retroperitoneale weefsel en spieren (Fig. 6A). Het schijfniveau werd bepaald met behulp van de bekkenrand als anatomisch oriëntatiepunt voor het L5-L6 schijfniveau. Gebruik een 16-gauge priknaald om een gat te boren nabij de eindplaat van de L5-wervel tot een diepte van 3 mm (Fig. 6B). Gebruik een spuit van 5 ml om de autologe nucleus pulposus in de tussenwervelschijf L1-L2 op te zuigen (Fig. 6C). Verwijder de nucleus pulposus of spier volgens de vereisten van elke groep. Nadat het boorgat is verdiept, worden absorbeerbare hechtingen op de diepe fascia, oppervlakkige fascia en huid geplaatst, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het periostale weefsel van het wervellichaam tijdens de operatie niet wordt beschadigd.
(A) De L5-L6-schijf wordt blootgelegd via een posterolaterale retroperitoneale benadering. (B) Gebruik een 16-gauge naald om een gat te boren nabij de L5-eindplaat. (C) Autologe MF's worden geoogst.
Algemene anesthesie werd toegediend met 20% urethaan (5 ml/kg), toegediend via de oorader, en röntgenfoto's van de lumbale wervelkolom werden 12, 16 en 20 weken postoperatief herhaald.
Konijnen werden gedood door intramusculaire injectie van ketamine (25,0 mg/kg) en intraveneus natriumpentobarbital (1,2 g/kg) 12, 16 en 20 weken na de operatie. De gehele wervelkolom werd verwijderd voor histologische analyse en er werd een echte analyse uitgevoerd. Kwantitatieve reverse transcriptie (RT-qPCR) en Western blotting werden gebruikt om veranderingen in immuunfactoren te detecteren.
MRI-onderzoeken werden uitgevoerd bij konijnen met behulp van een klinische magneet van 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) uitgerust met een orthogonale ledemaatspoelontvanger. Konijnen werden verdoofd met 20% urethaan (5 ml/kg) via de oorader en vervolgens op de rug in de magneet geplaatst met het lumbale gebied gecentreerd op een cirkelvormige oppervlakspiraal met een diameter van 5 inch (GE Medical Systems). Coronale T2-gewogen lokalisatorbeelden (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) werden verkregen om de locatie van de lumbale schijf van L3 – L4 tot L5 – L6 te definiëren. Sagittale vlak T2-gewogen plakjes werden verkregen met de volgende instellingen: snelle spin-echosequentie met een herhalingstijd (TR) van 2200 ms en een echotijd (TE) van 70 ms, matrix; gezichtsveld van 260 en acht stimuli; De snijdikte was 2 mm, de spleet was 0,2 mm.
Nadat de laatste foto was genomen en het laatste konijn was gedood, werden de schijnschijven, de in de spieren ingebedde schijven en de NP-schijven verwijderd voor histologisch onderzoek. Weefsels werden gedurende 1 week gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline, ontkalkt met ethyleendiaminetetra-azijnzuur en in paraffine gesneden. Weefselblokken werden ingebed in paraffine en met behulp van een microtoom in sagittale secties (5 μm dik) gesneden. Secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E).
Na het verzamelen van de tussenwervelschijven van de konijnen in elke groep werd totaal RNA geëxtraheerd met behulp van een UNIQ-10-kolom (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) volgens de instructies van de fabrikant en een ImProm II reverse transcriptiesysteem (Promega Inc. , Madison, WI, VS). Er werd omgekeerde transcriptie uitgevoerd.
RT-qPCR werd uitgevoerd met behulp van een Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., VS) en SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Het PCR-reactievolume was 20 μl en bevatte 1,5 μl verdund cDNA en 0,2 μM van elke primer. Primers zijn ontworpen door OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) en vervaardigd door Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) (Tabel 1). De volgende thermische cyclusomstandigheden werden gebruikt: initiële polymerase-activeringsstap bij 94°C gedurende 2 minuten, vervolgens 40 cycli van elk 15 seconden bij 94°C voor denaturatie van de matrijs, hybridisatie gedurende 1 minuut bij 60°C, verlenging en fluorescentie. Er werden metingen uitgevoerd gedurende 1 minuut bij 72°C. Alle monsters werden driemaal geamplificeerd en de gemiddelde waarde werd gebruikt voor RT-qPCR-analyse. Amplificatiegegevens werden geanalyseerd met behulp van FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, VS). IL-4-, IL-17- en IFN-y-genexpressie werden genormaliseerd naar de endogene controle (ACTB). Relatieve expressieniveaus van doel-mRNA werden berekend met behulp van de 2-ΔΔCT-methode.
Het totale eiwit werd uit weefsels geëxtraheerd met behulp van een weefselhomogenisator in RIPA-lysebuffer (die een protease- en fosfataseremmercocktail bevat) en vervolgens 20 minuten bij 4 ° C bij 13.000 rpm gecentrifugeerd om weefselresten te verwijderen. Vijftig microgram eiwit werd per baan geladen, gescheiden door 10% SDS-PAGE en vervolgens overgebracht naar een PVDF-membraan. Het blokkeren werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur uitgevoerd in 5% magere melkpoeder in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) die 0,1% Tween 20 bevatte. Het membraan werd overnacht bij 4 ° C geïncubeerd met konijn-anti-decorine primair antilichaam (verdund 1:200; Boster, Wuhan, China) (verdund 1:200; Bioss, Beijing, China) en reageerde op de tweede dagen; met secundair antilichaam (geit-anti-konijn-immunoglobuline G bij een verdunning van 1:40.000) gecombineerd met mierikswortelperoxidase (Boster, Wuhan, China) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Western blot-signalen werden gedetecteerd door verhoogde chemiluminescentie op het chemiluminescerende membraan na bestraling met röntgenstraling. Voor densitometrische analyse werden blots gescand en gekwantificeerd met behulp van BandScan-software en de resultaten werden uitgedrukt als de verhouding van de immunoreactiviteit van het doelgen tot de immunoreactiviteit van tubuline.
Statistische berekeningen werden uitgevoerd met behulp van het SPSS16.0-softwarepakket (SPSS, VS). Gegevens verzameld tijdens het onderzoek werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (gemiddelde ± SD) en geanalyseerd met behulp van variantieanalyse in één richting (ANOVA) om de verschillen tussen de twee groepen te bepalen. P <0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Het opzetten van een diermodel van MC door het implanteren van autologe NP’s in het wervellichaam en het uitvoeren van macro-anatomische observatie, MRI-analyse, histologische evaluatie en moleculair biologische analyse kan dus een belangrijk hulpmiddel worden voor het beoordelen en begrijpen van de mechanismen van menselijke MC en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische mogelijkheden. interventies.
Hoe dit artikel citeren: Han, C. et al. Een diermodel van Modische veranderingen werd opgesteld door autologe nucleus pulposus in het subchondrale bot van de lumbale wervelkolom te implanteren. Wetenschap Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., en Boos, N. Magnetische resonantiebeeldvorming van de lumbale wervelkolom: prevalentie van hernia en retentie, zenuwwortelcompressie, eindplaatafwijkingen en facetgewrichtartrose bij asymptomatische vrijwilligers . tarief. Radiologie 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, en Leboeuf-Eed, K. Modische veranderingen en hun relatie tot klinische bevindingen. European Spine Journal: officiële publicatie van de European Spine Society, de European Society of Spinal Deformity en de European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Modische veranderingen in de eindplaten van de lumbale wervels: prevalentie en associatie met lage rugpijn en ischias bij mannelijke werknemers van middelbare leeftijd. Rug 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., en Dalinka, M. MRI van beenmergveranderingen nabij de eindplaat bij degeneratieve ziekte van de lumbale wervelkolom. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, en Carter, JR Degeneratieve schijfziekte: evaluatie van wervelmergveranderingen met MRI. Radiologie 166, 193–199, doi: 10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS en Carter, JR Beeldvorming van degeneratieve schijfziekte. Radiologie 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Voorspellers van neovertebrale eindplaten (Modic) signaleren veranderingen in de algemene bevolking. European Spine Journal: officiële publicatie van de European Spine Society, de European Society of Spinal Deformity en de European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB en Mannisch, K. Modische veranderingen na lumbale hernia. European Spine Journal: officiële publicatie van de European Spine Society, de European Society of Spinal Deformity en de European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., en Kaapa, E. Modische type I-veranderingen kunnen snel progressieve deformatieve schijfdegeneratie voorspellen: een prospectief onderzoek van 1 jaar. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ en Fan, SW Modische veranderingen: mogelijke oorzaken en bijdrage aan degeneratie van de lumbale schijf. Medische hypothesen 73, 930-932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Interne schijfbreuk. Problemen met schijfverzakking gedurende 50 jaar. Ruggengraat (Phila Pa 1976) 11, 650-653 (1986).
Posttijd: 13 december 2024