Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor het beste resultaat raden we aan een nieuwere browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript.
Het opzetten van diermodellen voor modische veranderingen (MC) is een belangrijke basis voor het bestuderen van MC. Vierenvijftig Nieuw-Zeelandse Witte konijnen werden verdeeld in een schijnoperatiegroep, een spierimplantatiegroep (ME-groep) en een nucleus pulposus-implantatiegroep (NPE-groep). In de NPE-groep werd de tussenwervelschijf blootgelegd via een anterolaterale lumbale chirurgische benadering en werd met een naald een punctie uitgevoerd in het L5-wervellichaam nabij de eindplaat. De nucleus pulposus (NP) werd met een spuit uit de L1/2-tussenwervelschijf gehaald en daarin geïnjecteerd. Vervolgens werd een gat in het subchondrale bot geboord. De chirurgische procedures en boormethoden in de spierimplantatiegroep en de schijnoperatiegroep waren gelijk aan die in de NP-implantatiegroep. In de ME-groep werd een stukje spier in het gat geplaatst, terwijl in de schijnoperatiegroep niets in het gat werd geplaatst. Na de operatie werden MRI-scans en moleculair-biologische testen uitgevoerd. Het signaal in de NPE-groep veranderde, maar er was geen duidelijke signaalverandering in de schijnoperatiegroep en de ME-groep. Histologisch onderzoek toonde aan dat er abnormale weefselproliferatie werd waargenomen op de implantatieplaats en dat de expressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ verhoogd was in de NPE-groep. Implantatie van NP in het subchondrale bot kan een diermodel van MC vormen.
Modic-veranderingen (MC) zijn laesies van de wervelplaatjes en het aangrenzende beenmerg die zichtbaar zijn op magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Ze komen vrij vaak voor bij personen met bijbehorende symptomen¹. Veel studies hebben het belang van MC benadrukt vanwege de associatie met lage rugpijn (LRP)²,³. De Roos et al.⁴ en Modic et al.⁵ beschreven onafhankelijk van elkaar als eersten drie verschillende typen subchondrale signaalafwijkingen in het wervelbeenmerg. Modic type I-veranderingen zijn hypointens op T1-gewogen (T1W) sequenties en hyperintens op T2-gewogen (T2W) sequenties. Deze laesie toont fissuurvormige wervelplaatjes en aangrenzend vasculair granulatieweefsel in het beenmerg. Modic type II-veranderingen vertonen een hoog signaal op zowel T1W- als T2W-sequenties. Bij dit type laesie kan destructie van de wervelplaatjes worden gevonden, evenals histologische vette vervanging van het aangrenzende beenmerg. Modic type III-veranderingen vertonen een laag signaal op T1W- en T2W-sequenties. Er zijn sclerotische laesies waargenomen die overeenkomen met de eindplaten6. MC wordt beschouwd als een pathologische aandoening van de wervelkolom en is nauw verbonden met veel degeneratieve aandoeningen van de wervelkolom7,8,9.
Gezien de beschikbare gegevens hebben verschillende studies gedetailleerd inzicht gegeven in de etiologie en pathologische mechanismen van MC. Albert et al. suggereerden dat MC mogelijk wordt veroorzaakt door een hernia nucleus pulposus⁸. Hu et al. schreven MC toe aan ernstige degeneratie van de tussenwervelschijf¹⁰. Kroc introduceerde het concept van "interne discusruptuur", dat stelt dat herhaald trauma aan de tussenwervelschijf kan leiden tot microtrauma's in de eindplaat. Na de vorming van een spleet kan de vernietiging van de eindplaat door de nucleus pulposus (NP) een auto-immuunreactie op gang brengen, wat vervolgens leidt tot de ontwikkeling van MC¹¹. Ma et al. deelden een vergelijkbare visie en rapporteerden dat NP-geïnduceerde auto-immuniteit een sleutelrol speelt in de pathogenese van MC¹².
Immuunsysteemcellen, met name CD4+ T-helperlymfocyten, spelen een cruciale rol in de pathogenese van auto-immuniteit13. De recent ontdekte Th17-subgroep produceert het pro-inflammatoire cytokine IL-17, bevordert de expressie van chemokines en stimuleert T-cellen in beschadigde organen om IFN-γ te produceren14. Th2-cellen spelen ook een unieke rol in de pathogenese van immuunreacties. De expressie van IL-4 als representatieve Th2-cel kan leiden tot ernstige immunopathologische gevolgen15.
Hoewel er veel klinische studies zijn uitgevoerd naar MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, is er nog steeds een gebrek aan geschikte diermodellen die het MC-proces, dat vaak bij mensen voorkomt, kunnen nabootsen en die gebruikt kunnen worden om de etiologie of nieuwe behandelingen, zoals doelgerichte therapie, te onderzoeken. Tot nu toe zijn er slechts enkele diermodellen van MC beschreven die de onderliggende pathologische mechanismen bestuderen.
Gebaseerd op de auto-immuuntheorie van Albert en Ma, is in deze studie een eenvoudig en reproduceerbaar konijnenmodel voor MC ontwikkeld door autotransplantatie van NP nabij de geboorde wervelplaat. Andere doelstellingen zijn het observeren van de histologische kenmerken van de diermodellen en het evalueren van de specifieke mechanismen van NP bij de ontwikkeling van MC. Hiertoe gebruiken we technieken zoals moleculaire biologie, MRI en histologisch onderzoek om de progressie van MC te bestuderen.
Twee konijnen stierven aan bloedingen tijdens de operatie en vier konijnen stierven tijdens de narcose bij de MRI-scan. De overige 48 konijnen overleefden de operatie en vertoonden geen gedrags- of neurologische afwijkingen.
MRI-beelden tonen aan dat de signaalintensiteit van het ingebedde weefsel in verschillende gaten verschilt. De signaalintensiteit van het L5-wervellichaam in de NPE-groep veranderde geleidelijk na 12, 16 en 20 weken na implantatie (T1W-sequentie toonde een laag signaal en T2W-sequentie een gemengd signaal plus een laag signaal) (Fig. 1C), terwijl de MRI-beelden van de andere twee groepen ingebedde delen gedurende dezelfde periode relatief stabiel bleven (Fig. 1A, B).
(A) Representatieve sequentiële MRI-beelden van de lumbale wervelkolom van het konijn op 3 tijdstippen. Er werden geen signaalafwijkingen gevonden in de beelden van de schijnoperatiegroep. (B) De signaalkarakteristieken van het wervellichaam in de ME-groep zijn vergelijkbaar met die in de schijnoperatiegroep, en er wordt geen significante signaalverandering waargenomen op de implantatieplaats in de loop van de tijd. (C) In de NPE-groep is het lage signaal duidelijk zichtbaar in de T1W-sequentie, en het gemengde signaal en het lage signaal zijn duidelijk zichtbaar in de T2W-sequentie. Van de periode van 12 weken tot de periode van 20 weken nemen de sporadische hoge signalen rondom de lage signalen in de T2W-sequentie af.
Er is duidelijke bothyperplasie te zien op de implantatieplaats van het wervellichaam in de NPE-groep, en de bothyperplasie treedt sneller op tussen 12 en 20 weken (Fig. 2C) in vergelijking met de NPE-groep, waar geen significante verandering wordt waargenomen in de gemodelleerde wervellichamen; Sham-groep en ME-groep (Fig. 2C) 2A,B).
(A) Het oppervlak van het wervellichaam op de implantatieplaats is zeer glad, het gat geneest goed en er is geen hyperplasie in het wervellichaam. (B) De vorm van de implantatieplaats in de ME-groep is vergelijkbaar met die in de schijnoperatiegroep, en er is geen duidelijke verandering in het uiterlijk van de implantatieplaats in de loop van de tijd. (C) In de NPE-groep trad bothyperplasie op de implantatieplaats op. De bothyperplasie nam snel toe en breidde zich zelfs uit door de tussenwervelschijf naar het contralaterale wervellichaam.
Histologisch onderzoek levert meer gedetailleerde informatie over botvorming. Figuur 3 toont foto's van de postoperatieve coupes gekleurd met H&E. In de schijnoperatiegroep waren de chondrocyten goed gerangschikt en werd geen celproliferatie waargenomen (Fig. 3A). De situatie in de ME-groep was vergelijkbaar met die in de schijnoperatiegroep (Fig. 3B). In de NPE-groep werd echter een groot aantal chondrocyten en proliferatie van NP-achtige cellen waargenomen op de implantatieplaats (Fig. 3C).
(A) Trabeculae zijn zichtbaar nabij de eindplaat, de chondrocyten zijn netjes gerangschikt met een uniforme celgrootte en -vorm en vertonen geen proliferatie (40x vergroting). (B) De toestand van de implantatieplaats in de ME-groep is vergelijkbaar met die van de sham-groep. Trabeculae en chondrocyten zijn zichtbaar, maar er is geen duidelijke proliferatie op de implantatieplaats (40x vergroting). (B) Het is te zien dat chondrocyten en NP-achtige cellen significant prolifereren, en de vorm en grootte van de chondrocyten zijn ongelijk (40x vergroting).
De expressie van interleukine 4 (IL-4) mRNA, interleukine 17 (IL-17) mRNA en interferon γ (IFN-γ) mRNA werd waargenomen in zowel de NPE- als de ME-groep. Bij vergelijking van de expressieniveaus van de doelgenen bleek de genexpressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ significant verhoogd in de NPE-groep vergeleken met die van de ME-groep en de schijnoperatiegroep (Fig. 4) (P < 0,05). Vergeleken met de schijnoperatiegroep was de expressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ in de ME-groep slechts licht verhoogd en niet statistisch significant (P > 0,05).
De mRNA-expressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ in de NPE-groep vertoonde een significant hogere trend dan die in de schijnoperatiegroep en de ME-groep (P < 0,05).
Daarentegen vertoonden de expressieniveaus in de ME-groep geen significant verschil (P>0,05).
Western blot-analyse werd uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare antilichamen tegen IL-4 en IL-17 om het gewijzigde mRNA-expressiepatroon te bevestigen. Zoals weergegeven in figuren 5A en 5B, waren de eiwitniveaus van IL-4 en IL-17 in de NPE-groep significant verhoogd (P < 0,05) in vergelijking met de ME-groep en de schijnoperatiegroep. In vergelijking met de schijnoperatiegroep vertoonden de eiwitniveaus van IL-4 en IL-17 in de ME-groep geen statistisch significante veranderingen (P > 0,05).
(A) De eiwitniveaus van IL-4 en IL-17 in de NPE-groep waren significant hoger dan die in de ME-groep en de placebogroep (P < 0,05). (B) Histogram van de Western blot.
Vanwege het beperkte aantal menselijke monsters dat tijdens een operatie wordt verkregen, zijn duidelijke en gedetailleerde studies naar de pathogenese van MC enigszins lastig. We hebben geprobeerd een diermodel van MC te ontwikkelen om de potentiële pathologische mechanismen ervan te bestuderen. Tegelijkertijd werden radiologische, histologische en moleculair-biologische evaluaties gebruikt om het verloop van MC, geïnduceerd door NP-autotransplantatie, te volgen. Het NP-implantatiemodel resulteerde in een geleidelijke verandering in signaalintensiteit tussen 12 en 20 weken (een combinatie van een laag signaal in T1W-sequenties en een laag signaal in T2W-sequenties), wat wijst op weefselveranderingen. De histologische en moleculair-biologische evaluaties bevestigden de resultaten van het radiologische onderzoek.
De resultaten van dit experiment tonen aan dat er visuele en histologische veranderingen optraden op de plaats van de aantasting van het wervellichaam in de NPE-groep. Tegelijkertijd werd de expressie van de genen IL-4, IL-17 en IFN-γ waargenomen, wat erop wijst dat de aantasting van het autologe nucleus pulposus-weefsel in het wervellichaam een reeks signaal- en morfologische veranderingen kan veroorzaken. Het is duidelijk dat de signaalkarakteristieken van de wervellichamen van het diermodel (laag signaal in de T1W-sequentie, gemengd signaal en laag signaal in de T2W-sequentie) sterk overeenkomen met die van menselijke wervelcellen. De MRI-kenmerken bevestigen de histologische en macroscopische waarnemingen, namelijk dat de veranderingen in de wervellichaamcellen progressief zijn. Hoewel de ontstekingsreactie veroorzaakt door acuut trauma kort na de punctie kan optreden, toonden MRI-resultaten aan dat progressief toenemende signaalveranderingen 12 weken na de punctie verschenen en tot 20 weken aanhielden zonder tekenen van herstel of omkering van de MRI-veranderingen. Deze resultaten suggereren dat autologe vertebrale NP een betrouwbare methode is voor het tot stand brengen van progressieve MV bij konijnen.
Dit punctiemodel vereist voldoende vaardigheid, tijd en chirurgische inspanning. In voorlopige experimenten kan dissectie of overmatige stimulatie van de paravertebrale ligamenten leiden tot de vorming van wervelosteofyten. Er moet zorgvuldig worden gehandeld om de aangrenzende tussenwervelschijven niet te beschadigen of te irriteren. Omdat de penetratiediepte gecontroleerd moet worden om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, hebben we handmatig een plug gemaakt door de huls van een 3 mm lange naald af te snijden. Het gebruik van deze plug zorgt voor een uniforme boordiepte in het wervellichaam. In voorlopige experimenten vonden drie orthopedisch chirurgen die bij de operatie betrokken waren, dat 16-gauge naalden gemakkelijker te hanteren waren dan 18-gauge naalden of andere methoden. Om overmatig bloeden tijdens het boren te voorkomen, zorgt het even stilhouden van de naald voor een geschikter insteekgat, wat suggereert dat op deze manier een zekere mate van MC (microscopische compressie) kan worden gecontroleerd.
Hoewel veel studies zich hebben gericht op MC, is er weinig bekend over de etiologie en pathogenese van MC25,26,27. Op basis van onze eerdere studies hebben we vastgesteld dat auto-immuniteit een belangrijke rol speelt bij het ontstaan en de ontwikkeling van MC12. In deze studie werd de kwantitatieve expressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ onderzocht, de belangrijkste differentiatieroutes van CD4+ cellen na antigene stimulatie. In onze studie vertoonde de NPE-groep, vergeleken met de negatieve controlegroep, een hogere expressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ, en waren de eiwitniveaus van IL-4 en IL-17 ook hoger.
Klinisch gezien is de IL-17 mRNA-expressie verhoogd in NP-cellen van patiënten met een hernia nucleus pulposus28. Verhoogde IL-4- en IFN-γ-expressieniveaus werden ook gevonden in een acuut niet-compressief hernia nucleus pulposus-model vergeleken met gezonde controles29. IL-17 speelt een belangrijke rol bij ontsteking en weefselbeschadiging bij auto-immuunziekten30 en versterkt de immuunrespons op IFN-γ31. Verhoogde IL-17-gemedieerde weefselbeschadiging is gerapporteerd bij MRL/lpr-muizen32 en muizen die vatbaar zijn voor auto-immuunziekten33. IL-4 kan de expressie van pro-inflammatoire cytokines (zoals IL-1β en TNFα) en macrofaagactivatie remmen34. Er werd gerapporteerd dat de mRNA-expressie van IL-4 in de NPE-groep verschilde van die van IL-17 en IFN-γ op hetzelfde tijdstip; de mRNA-expressie van IFN-γ in de NPE-groep was significant hoger dan die in de andere groepen. Daarom kan de productie van IFN-γ een mediator zijn van de ontstekingsreactie die wordt veroorzaakt door NP-intercalatie. Studies hebben aangetoond dat IFN-γ wordt geproduceerd door meerdere celtypen, waaronder geactiveerde type 1 helper-T-cellen, natural killer-cellen en macrofagen35,36, en dat het een belangrijke pro-inflammatoire cytokine is die immuunreacties bevordert37.
Deze studie suggereert dat een auto-immuunreactie mogelijk betrokken is bij het ontstaan en de ontwikkeling van MC. Luoma et al. ontdekten dat de signaalkenmerken van MC en prominente NP op MRI vergelijkbaar zijn en dat beide een hoog signaal vertonen in de T2W-sequentie38. Van sommige cytokinen is bevestigd dat ze nauw verband houden met het ontstaan van MC, zoals IL-139. Ma et al. suggereerden dat de opwaartse of neerwaartse uitstulping van NP een grote invloed kan hebben op het ontstaan en de ontwikkeling van MC12. Bobechko40 en Herzbein et al.41 rapporteerden dat NP een immuuntolerant weefsel is dat vanaf de geboorte niet in de bloedsomloop kan komen. Uitstulpingen van NP introduceren vreemde lichamen in de bloedbaan, waardoor lokale auto-immuunreacties worden veroorzaakt42. Auto-immuunreacties kunnen een groot aantal immuunfactoren induceren, en wanneer deze factoren continu aan weefsels worden blootgesteld, kunnen ze veranderingen in de signalering veroorzaken43. In deze studie is de overexpressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ, typische immuunfactoren, aangetoond, wat de nauwe relatie tussen NP en MCs44 verder bewijst. Dit diermodel bootst de doorbraak van NP en de toegang tot de eindplaat goed na. Dit proces onthult bovendien de impact van auto-immuniteit op MC.
Zoals verwacht biedt dit diermodel ons een mogelijk platform om MC te bestuderen. Dit model kent echter nog enkele beperkingen: ten eerste moeten tijdens de observatiefase van de dieren sommige konijnen in een tussenstadium worden geëuthanaseerd voor histologisch en moleculair biologisch onderzoek, waardoor sommige dieren na verloop van tijd "niet meer bruikbaar" zijn. Ten tweede, hoewel er in deze studie drie meetmomenten zijn vastgesteld, hebben we helaas slechts één type MC (Modic type I-verandering) gemodelleerd, waardoor het niet voldoende is om het ziekteontwikkelingsproces bij de mens te representeren. Meer meetmomenten zijn nodig om alle signaalveranderingen beter te kunnen observeren. Ten derde, hoewel de veranderingen in de weefselstructuur duidelijk kunnen worden aangetoond met histologische kleuring, kunnen sommige gespecialiseerde technieken de microstructurele veranderingen in dit model beter in beeld brengen. Zo werd bijvoorbeeld gepolariseerde lichtmicroscopie gebruikt om de vorming van fibrocartilage in de tussenwervelschijven van konijnen te analyseren45. De langetermijneffecten van NP op MC en de eindplaat vereisen verder onderzoek.
Vierenvijftig mannelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen (gewicht circa 2,5-3 kg, leeftijd 3-3,5 maanden) werden willekeurig verdeeld in een schijnoperatiegroep, een spierimplantatiegroep (ME-groep) en een zenuwwortelimplantatiegroep (NPE-groep). Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het Tianjin Ziekenhuis en de experimentele methoden werden strikt volgens de goedgekeurde richtlijnen uitgevoerd.
Er zijn enkele verbeteringen aangebracht aan de chirurgische techniek van S. Sobajima 46. Elk konijn werd in zijligging geplaatst en het voorste oppervlak van vijf opeenvolgende lumbale tussenwervelschijven (IVD's) werd blootgelegd met behulp van een posterolaterale retroperitoneale benadering. Elk konijn werd onder algehele anesthesie gebracht (20% urethaan, 5 ml/kg via de oorader). Er werd een longitudinale huidincisie gemaakt vanaf de onderrand van de ribben tot aan de bekkenrand, 2 cm ventraal van de paravertebrale spieren. De rechter anterolaterale wervelkolom van L1 tot L6 werd blootgelegd door scherpe en stompe dissectie van het bovenliggende subcutane weefsel, retroperitoneaal weefsel en spieren (Fig. 6A). Het niveau van de tussenwervelschijf werd bepaald met behulp van de bekkenrand als anatomisch oriëntatiepunt voor het L5-L6-niveau. Gebruik een punctienaald van 16 gauge om een gat te boren nabij de eindplaat van de L5-wervel tot een diepte van 3 mm (Fig. 6B). Gebruik een spuit van 5 ml om de autologe nucleus pulposus in de L1-L2 tussenwervelschijf te aspireren (Fig. 6C). Verwijder de nucleus pulposus of spierweefsel, afhankelijk van de behoeften van de betreffende groep. Nadat het boorgat is verdiept, worden resorbeerbare hechtingen aangebracht op de diepe fascie, de oppervlakkige fascie en de huid, waarbij erop gelet wordt dat het periostweefsel van het wervellichaam tijdens de operatie niet wordt beschadigd.
(A) De L5-L6-schijf wordt blootgelegd via een posterolaterale retroperitoneale benadering. (B) Met een naald van 16 gauge wordt een gat geboord nabij de L5-eindplaat. (C) Autologe MFs worden geoogst.
Er werd algehele anesthesie toegediend met 20% urethaan (5 ml/kg) via de oorader, en er werden röntgenfoto's van de lumbale wervelkolom herhaald na 12, 16 en 20 weken postoperatief.
Konijnen werden geëuthanaseerd door middel van intramusculaire injectie van ketamine (25,0 mg/kg) en intraveneuze toediening van natriumpentobarbital (1,2 g/kg) op 12, 16 en 20 weken na de operatie. De gehele wervelkolom werd verwijderd voor histologisch onderzoek en er werd een kwantitatieve analyse uitgevoerd. Kwantitatieve reverse transcriptie (RT-qPCR) en Western blotting werden gebruikt om veranderingen in immuunfactoren te detecteren.
MRI-onderzoeken werden uitgevoerd bij konijnen met behulp van een klinische 3,0 T-magneet (GE Medical Systems, Florence, SC) uitgerust met een orthogonale ledemaatspoelontvanger. De konijnen werden verdoofd met 20% urethaan (5 ml/kg) via de oorader en vervolgens in rugligging in de magneet geplaatst, waarbij de lumbale regio gecentreerd was op een cirkelvormige oppervlaktespoel met een diameter van 5 inch (GE Medical Systems). Coronale T2-gewogen lokalisatiebeelden (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) werden verkregen om de locatie van de lumbale tussenwervelschijf van L3-L4 tot L5-L6 te bepalen. Sagittale T2-gewogen coupes werden verkregen met de volgende instellingen: snelle spin-echo-sequentie met een herhalingstijd (TR) van 2200 ms en een echotijd (TE) van 70 ms, matrix; gezichtsveld van 260 en acht stimuli; de snijdikte was 2 mm, de tussenruimte was 0,2 mm.
Nadat de laatste foto was genomen en het laatste konijn was gedood, werden de schijnbehandelde, in spierweefsel ingebedde en NP-schijven verwijderd voor histologisch onderzoek. De weefsels werden gedurende een week gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline, gedecalcificeerd met ethyleendiaminetetraazijnzuur en in paraffine gesneden. De weefselblokken werden ingebed in paraffine en met een microtoom in sagittale coupes (5 μm dik) gesneden. De coupes werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E).
Na het verzamelen van de tussenwervelschijven van de konijnen in elke groep werd het totale RNA geëxtraheerd met behulp van een UNIQ-10 kolom (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) volgens de instructies van de fabrikant en een ImProm II reverse transcriptiesysteem (Promega Inc., Madison, WI, VS). Vervolgens werd reverse transcriptie uitgevoerd.
RT-qPCR werd uitgevoerd met een Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., VS) en SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Het PCR-reactievolume bedroeg 20 μl en bevatte 1,5 μl verdund cDNA en 0,2 μM van elke primer. De primers werden ontworpen met OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) en geproduceerd door Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) (Tabel 1). De volgende thermische cycluscondities werden gebruikt: een initiële polymerase-activeringsstap bij 94 °C gedurende 2 min, gevolgd door 40 cycli van elk 15 s bij 94 °C voor template-denaturatie, annealing gedurende 1 min bij 60 °C, extensie en fluorescentiemetingen gedurende 1 min bij 72 °C. Alle monsters werden driemaal geamplificeerd en de gemiddelde waarde werd gebruikt voor RT-qPCR-analyse. De amplificatiegegevens werden geanalyseerd met FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, VS). De genexpressie van IL-4, IL-17 en IFN-γ werd genormaliseerd ten opzichte van de endogene controle (ACTB). De relatieve expressieniveaus van het doel-mRNA werden berekend met behulp van de 2-ΔΔCT-methode.
Totale eiwitten werden uit weefsels geëxtraheerd met behulp van een weefselhomogenisator in RIPA-lysisbuffer (bevat een cocktail van protease- en fosfataseremmers) en vervolgens gecentrifugeerd bij 13.000 tpm gedurende 20 minuten bij 4°C om weefselresten te verwijderen. Vijftig microgram eiwit werd per lane geladen, gescheiden door 10% SDS-PAGE en vervolgens overgebracht naar een PVDF-membraan. Blokkeren werd uitgevoerd in 5% magere melkpoeder in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% Tween 20 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Het membraan werd 's nachts bij 4°C geïncubeerd met een primair konijnen-anti-decorine-antilichaam (verdund 1:200; Boster, Wuhan, China) (verdund 1:200; Bioss, Beijing, China) en de reactie vond de volgende dag plaats. met een secundair antilichaam (geiten-anti-konijn-immunoglobuline G in een verdunning van 1:40.000) gecombineerd met mierrettichperoxidase (Boster, Wuhan, China) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Western blot-signalen werden gedetecteerd door een toename van de chemiluminescentie op het chemiluminescentiemembraan na röntgenbestraling. Voor densitometrische analyse werden de blots gescand en gekwantificeerd met behulp van BandScan-software en de resultaten werden uitgedrukt als de verhouding van de immunoreactiviteit van het doelgen tot de immunoreactiviteit van tubuline.
Statistische berekeningen werden uitgevoerd met behulp van het SPSS 16.0 softwarepakket (SPSS, VS). De tijdens het onderzoek verzamelde gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (gemiddelde ± SD) en geanalyseerd met behulp van een eenzijdige variantieanalyse met herhaalde metingen (ANOVA) om verschillen tussen de twee groepen te bepalen. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Het opzetten van een diermodel voor MC door het implanteren van autologe NPs in het wervellichaam en het uitvoeren van macroanatomische observaties, MRI-analyses, histologische evaluaties en moleculair-biologische analyses kan daarom een belangrijk instrument worden voor het beoordelen en begrijpen van de mechanismen van menselijke MC en voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische interventies.
Hoe dit artikel te citeren: Han, C. et al. Een diermodel van Modic-veranderingen werd ontwikkeld door het implanteren van autoloog nucleus pulposus in het subchondrale bot van de lumbale wervelkolom. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., en Boos, N. Magnetische resonantiebeeldvorming van de lumbale wervelkolom: prevalentie van hernia nuclei pulposi en retentie van de tussenwervelschijf, zenuwwortelcompressie, afwijkingen aan de eindplaten en artrose van de facetgewrichten bij asymptomatische vrijwilligers. Radiologie 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, en Leboeuf-Eed, K. Modic-veranderingen en hun relatie tot klinische bevindingen. European Spine Journal: officiële publicatie van de European Spine Society, de European Society of Spinal Deformity en de European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Modic-veranderingen in de eindplaten van de lumbale wervels: prevalentie en verband met lage rugpijn en ischias bij mannelijke werknemers van middelbare leeftijd. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., en Dalinka, M. MRI van beenmergveranderingen nabij de eindplaat bij degeneratieve aandoeningen van de lumbale wervelkolom. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, en Carter, JR. Degeneratieve schijfziekte: evaluatie van veranderingen in het wervelmerg met MRI. Radiologie 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, en Carter, JR. Beeldvorming van degeneratieve schijfziekte. Radiologie 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Voorspellers van veranderingen in het Modic-signaal (van de neovertebrale eindplaat) in de algemene bevolking. European Spine Journal: Officiële publicatie van de European Spine Society, de European Society of Spinal Deformity en de European Society for Cervical Spine Research, Afdeling 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB en Mannisch, K. Modic-veranderingen na lumbale hernia. European Spine Journal: Officiële publicatie van de European Spine Society, de European Society of Spinal Deformity en de European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., en Kaapa, E. Modic type I-veranderingen kunnen snel progressieve deformatieve discusdegeneratie voorspellen: een prospectieve studie van 1 jaar. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ en Fan, SW Modic-veranderingen: mogelijke oorzaken en bijdrage aan lumbale discusdegeneratie. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Interne discusruptuur. Problemen met discusprolaps gedurende meer dan 50 jaar. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Geplaatst op: 13 december 2024